2021年12月30日，復旦大學附屬中山醫院樊嘉院士、中國科學院上海藥物研究所周虎研究員、中國科學院分子細胞科學卓越創新中心高大明研究員和復旦大學附屬中山醫院高強教授課題組，在Cancer Cell上發表重磅級研究成就成果“Proteogenomic characterization identifies clinically relevant subgroups of intrahepatic cholangiocarcinoma”。此項研究是樊嘉院士團隊繼2019年肝細胞癌分子分型登頂國際頂刊Cell、以及2019與賀福初院士團隊合作的早期肝細胞蛋白組登頂Nature之后的又一力作。
肝內膽管癌(iCCA)是第二常見的原發性肝惡性腫瘤。在未來20至30年，iCCA的發病率預計將在全球范圍內增加多達10倍，但治療策略仍然有限。大多數患者通常是在晚期確診的，此時可用的系統療法的有效性有限。因此，迫切需要對iCCA的發病機制進行更深入的了解，以幫助確定合適的治療靶點。研究團隊基于基因組、轉錄組、蛋白質組和磷酸化修飾組、微生物組等多組學技術對262例肝內膽管癌患者癌與癌旁組織進行聯合分析，整合的蛋白質基因組分析表明，遺傳改變可能驅動表型擾動，并揭示了具有不同特征和預后的疾病亞群，這描述了iCCA發病機制的復雜機制，為未來的精準治療探索提供了前景。
01中國肝內膽管癌（iCCA）的蛋白質基因組圖譜
為了描述中國iCCA的蛋白質基因組圖譜，前瞻性收集了262例未接受治療的iCCA腫瘤和成對的鄰近非腫瘤肝組織(復旦大學[FU]iCCA隊列)，共鑒定出12,197個非同義體點突變和603個突變，10529個蛋白和62879個磷酸位點。在所有的214個樣本中定量了5690個蛋白和2761個磷酸化蛋白。在蛋白質水平上共確認了1413(1.60%)非同義體細胞變異。FU-iCCA基因改變的情況與之前的報道大體一致，發現了16個顯著改變的驅動基因，包括tp53、KRAS、FGFR2、IDH1/2、BAP1、ARID1A和pbrm1。值得注意的是，FU-iCCA隊列比由西方iCCA人群組成的MSKCC隊列顯示更高的KRAS突變頻率，更低的IDH1,ARID1A和TERT突變頻率。在FU-iCCA隊列的7.1%和Zou等人隊列9.7%的樣本中觀察到黃曲霉毒素特征，這兩組均為中國隊列，但在三個西方隊列中均不存在。馬兜鈴酸(AA)特征也觀察到了類似的趨勢。具有黃曲霉毒素和AA特征的樣本，TMB和新抗原負荷顯著升高。TP53突變，尤其是R249S突變與黃曲霉毒素特征顯著相關，這與之前的報道一致，黃曲霉毒素可誘導R249S改變，提示黃曲霉毒素在iCCA致癌性中發揮作用。
02多組學分析體細胞拷貝數變化
最常見的增生發生在染色體6p21.33(43.5%)和1q21.3(33.2%)，最常見的缺失發生在染色體5q23.3(20.2%)和1p36.11(20.2%)，這與之前的研究一致。39.3%(101/253)的FU-iCCA至少存在1個可操作的基因突變，其中突變61例，高TMB 9例，融合32例，擴增4例。這些拷貝數改變(CNAs)在mRNA、蛋白質和磷酸化蛋白分別觀察到總計3981、1081和408個顯著的順式相關性，在所有3個組學一致的只有194個顯著的順式相關性。總共有963個蛋白質同時顯示了CNA-mRNA和CNA-蛋白順式調控作用，主要富集在代謝、生物合成和蛋白質加工途徑中。在723個癌癥基因普查(CGC)中，15個CGC基因顯示了顯著重疊的CNA-mRNA和CNA-蛋白調控。反式調控的前10事件中，其中MDM4擴增與免疫治療的高進展相關。在染色體1p和14q中，顯示出數量最多的CNA-蛋白和CNA-mRNA反式調控事件。配對的轉錄組和蛋白質組數據的相關性分析顯示，5434對mRNA-蛋白中97.15%呈正相關，2.85%呈負相關。這些強mRNA-蛋白正相關性在代謝和造血細胞系通路中富集，而那些弱相關性或負相關性涉及核糖體、剪接體和氧化磷酸化過程。
03蛋白質基因組關聯分析
重點分析4個突變最顯著的驅動基因(TP53、KRAS、IDH1/2和BAP1)。在FU-iCCA隊列中，TP53和KRAS突變與較差的生存期顯著相關，而BAP1或IDH1 /2突變與患者生存期無關。TP53突變與細胞周期、藥物代謝、吞噬小體和碳代謝通路上調相關，與ECM-黏著斑、PI3K-AKT和Hippo-YAP信號通路下調相關。KRAS突變與炎癥-感染和ECM-黏著斑蛋白增加有關，與細胞周期通路中的蛋白減少有關。有趣的是，隊列中的10/215名iCCA患者存在TP53和KRAS共突變，且生存率明顯低于TP53或KRAS單突變患者。TP53和KRAS共突變可能通過整合素-FAK-SRC途徑促進iCCA的轉移和進展。在BAP1突變和IDH1/2突變腫瘤中，ECM和膽汁分泌通路是相互活躍的，而吞噬體、炎癥和MAPK通路僅在其中一種腫瘤類型中相對活躍。對患者來源的原發癌細胞株進行RNAi和化學抑制劑治療，成功驗證了細胞周期相關因子、ECM相互作用和激酶信號因子等治療靶點。
04與FGFR2變化和KRAS突變相關的磷酸化蛋白組畸變
FGFR2的改變和KRAS突變可能會影響MAPK、PI3K-AKT-mTOR和Rho GTPase通路, 我們研究了有和沒有這些改變的腫瘤中顯著改變的磷酸位點及其相應的蛋白表達。KRAS突變的腫瘤表現出明顯的MAPK通路級聯激活，如MAPK14在T180和Y182位點磷酸化，MAP3K2在S514位點磷酸化，RPS6KA4在S343和T687位點的磷酸化。與之相反，FGFR2突變的腫瘤MAPK通路輕微下調，而Rho GTPase通路顯著上調。此外，FGFR2改變的腫瘤表現出顯著的PTPN11 (Y62)和TLN1 (Y70)酪氨酸磷酸化，在蛋白水平上觀察到相似的趨勢。除了FGFR2抑制劑外，抑制PTPN11可能是一種有希望的治療FGFR2改變人群的治療策略。
05鑒定來自FGFR2::BICC1融合和相應T細胞應答的潛在新表位
基因融合可以產生個性化免疫治療的候選多肽。對于兩個最常見的FGFR2::BICC1融合蛋白，通過四聚體交換實驗，一組合成的肽被成功地交換成HLA-A02:01和HLA-A24:02四聚體。此外，我們還生成了iCCA細胞株HuCCT1和HCCC-9810，它們異位表達FGFR2:BICC1融合蛋白。MHC-I免疫肽直接檢測FGFR2:BICC1過表達的HuCCT1細胞的融合肽LTLTTNEIME。這些結果支持了融合多肽可以由相應的HLA等位基因表達。來自三個健康供者的外周血單核細胞（PBMCs）被用于體外刺激新抗原特異性T細胞反應，與上述融合肽共培養。當供者1和供者2的外周血單核細胞與多肽32和33共培養，IFN-γ分泌顯著上調，而供體3對這些多肽均無反應。盡管供體間存在異質性，但低頻率的新表位T細胞反應性為iCCA融合患者克服免疫編輯和耐藥性提供了有價值的信息。
06具有明顯生物學和臨床特征的蛋白質組亞群
對1376個變化的蛋白進行聚類，鑒定出4個不同的蛋白質組亞群(S1-S4)，這些蛋白具有不同的臨床、基因組、免疫學和微環境特征。S1中CD14、MPO、C5AR1等炎癥蛋白表達最為豐富。S2與癌癥相關的成纖維細胞和ECM相關的蛋白水平最高，包括FAP、POSTN和FLT1。S3的特征是MAPK和代謝蛋白(如ACAT1、FASN和IDH1)升高。S4保留了最大限度的粘附蛋白和膽道特異性蛋白的表達，如ANXA4、KRT18和EPCAM。
臨床上S1多為CA19-9水平升高、腫瘤壞死、肝內轉移的腫瘤。S2有較高的淋巴結轉移。S3以HBV感染患者為特征。S4主要富集于CA19-9水平較低、轉移較少的患者。4個蛋白質組亞組的總生存期(OS)差異顯著，S1-S4的中位OS分別為17.2、25.3、36.7和>60個月。每個亞組都顯示了不同的周期性改變的基因。KRAS突變在S1中顯著富集，炎癥通路上調。S3中以TP53突變為主，并伴有細胞周期和MAPK信號通路的豐富。FGFR2突變、BAP1突變和IDH1 /2突變在S4中最常見，部分與膽汁分泌升高相關。
四個亞組特異性標志物MPO(中性粒細胞)、POSTN(成纖維細胞)、ALDOB(代謝)和EPCAM(膽道)分別代表炎癥(S1)、間充質(S2)、代謝(S3)和分化(S4)。在FU-iCCA隊列(n = 84)和驗證隊列(n = 144)中，通過多重免疫染色測量的4個標記物的表達可以分層患者的生存。同時，通過mRNA和磷酸化蛋白的聚類，我們還分別鑒定出三個具有顯著預后值的轉錄組亞組和三個磷酸化蛋白組亞組。轉錄組和磷酸化蛋白質組的分類與蛋白質組的聚類有部分重疊和不同的分子特征。
07預后蛋白質組學生物標志物的鑒定和驗證
監督分析來識別預后生物標志物，通過嚴格的篩選過程發現19個預后良好的蛋白和15個預后不良的蛋白。其中，HKDC1和SLC16A3在FU-iCCA隊列中分別與患者生存呈正相關或負相關，與常規臨床病理特征無關，在四個蛋白質組亞組間存在顯著差異，S1中SLC16A3表達上調，S4中HKDC1表達上調。在另一個獨立的iCCA隊列中，通過免疫染色檢測HKDC1低表達和SLC16A3高表達分別預示較差的臨床結果。實驗結果表明，HKDC1和SLC16A3作為強有力的預后標志物，在iCCA中分別作為抑癌因子和強致癌因子。
08整合微生物組分析到蛋白質基因組圖譜
為了研究iCCA組織細菌與癌癥進展之間可能的關系，16S rRNA測序獲得了從4個蛋白質組亞組中隨機等分選擇的80對iCCA的微生物群組成。幾種不同的測量腫瘤微生物alpha多樣性的方法均發現alpha多樣性從S1的最高到S4的最低呈下降趨勢。然而，腫瘤與相鄰肝臟組織間的微生物alpha多樣性無顯著差異。在4個亞群中，共有12個屬被鑒定為差異豐富?！皌ranskingdom”相關分析顯示，在S1和S3中OTUs與亞群特征蛋白之間存在強烈的正相關，而在S2和S4中存在負相關。宏基因組功能分析顯示，來自四個亞組的KEGG通路模塊豐富，如生物合成和炎癥通路。因此，這四個蛋白質組亞群具有不同的腫瘤微生物多樣性、組成和功能，可能在免疫和代謝重塑中發揮重要作用。
結 論
利用262例患者的配對腫瘤和鄰近肝組織對肝內膽管癌(iCCA)進行了蛋白質基因組表征，揭示了iCCA發病機制的特征。黃曲霉毒素特征與腫瘤的發生、增殖和免疫抑制有關。突變相關的信號特征顯示TP 53和KRAS突變可能通過整合素- FAK- SRC途徑促進iCCA轉移。FGFR2融合激活Rho GTPase通路，可能是新抗原的潛在來源。蛋白質組分析識別出4個患者亞群(S1-S4)，并具有亞群特異性的生物標志物。這些蛋白質組在預后、基因改變、微環境失調、腫瘤微生物組成和潛在的治療方面具有明顯的特征。SLC16A3和HKDC1被進一步鑒定為與iCCA細胞代謝重編程相關的潛在預后生物標志物。本研究為研究人員和臨床醫生進一步確定iCCA的分子發病機制和治療機會提供了寶貴的資源。
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