編者按
近年來，基因編輯技術的發展為生命科學研究帶來了革命性的變化，特別是CRISPR-Cas13 RNA靶向系統在基礎和應用科學中被廣泛使用，成為了科研人員的有力工具。然而，在哺乳動物細胞和小鼠模型中出現的旁切效應，及在體內的靶向能力還有待提高，效率不穩定等因素，限制了其在體內的應用。
今天，我們分享2025年3月由西班牙安達盧西亞發育生物學中心等研究團隊聯合在Nature Communications（IF=16.6）上發表的最新研究成果。該研究提供了一套優化的、經過驗證的策略工具箱，通過瞬時方法優化了斑馬魚中RNA靶向CRISPR-Cas技術，顯著提升了在斑馬魚中進行高效、特異、安全的RNA靶向研究的潛力，為CRISPR-Cas技術在體內的應用提供了新思路、新方法，并為更廣泛的潛在治療鋪平了道路。
文章題目
Enhanced RNA-targeting CRISPR-Cas technology in zebra?sh
雜志：Nature Communications（IF=16.6）
發表時間：2025年3月16日
作者：Ismael Moreno-Sánchez，Ariel A. Bazzini & Miguel A. Moreno-Mateos et al.
單位：西班牙安達盧西亞發育生物學中心、西班牙巴勃羅.德.奧拉維德大學、西班牙神經科學研究所等
DOI: 10.1038/s41467-025-57792-9
01、研究亮點
• 通過瞬時方法提出了五種互補的斑馬魚RNA靶向的CRISPR-Cas技術優化策略，cm-gRNA、NLS組合優化、IVTed gRNA毒性篩查、RNAtargeting模型預測、替代系統等；
• 通過斑馬魚胚胎模型評估并優化了RNA靶向的CRISPR-Cas技術，旨在解決應用中存在的晚期基因靶向效率低、部分體外轉錄gRNA毒性、核RNA靶向困難、gRNA活性預測不準、附帶活性無法表征等問題，顯著增強了斑馬魚中RNA靶向CRISPR-Cas技術的效率和適用性；
• 一整套技術創新策略，為CRISPR-Cas13技術在基于RNA敲降的生物技術和生物醫學治療應用，尤其是瞬時遞送場景中的安全性和有效性提供了重要依據和優化策略。
02、研究背景
RfxCas13d是一種來自黃化瘤胃球菌XPD3002的Cas13d蛋白（CasRx）的II類/VI型CRISPR-Cas RNA核酸內切酶，它與向導RNA（gRNA）一起通過RNA-RNA雜交靶向RNA。CRISPR-RfxCas13d系統已被廣泛用于消除RNA，在生物技術及醫學領域具有巨大的潛力。研究人員最近利用核糖核蛋白（RNP）復合物或mRNA-gRNA遞送技術，在體內優化了CRISPR-RfxCas13d技術，使其可以在斑馬魚、青鳉魚、小鼠等動物胚胎中實現有效、瞬時和細胞質mRNA敲降（KD）。這些方法也被用于標記斑馬魚胚胎生成過程中的mRNA，擴展了該技術在體內的應用。
然而，研究人員通過探究確定了晚期基因靶向效率低、部分體外轉錄gRNA毒性、核RNA靶向困難、gRNA活性預測不準、附帶活性無法表征等一系列待解決的限制因素，以進一步擴展CRISPR-RfxCas13d系統在體內的能力。
本研究使用斑馬魚模型的不同方法，在體內增強RNA靶向CRISPR-Cas技術，并優化了瞬時遞送制劑，作為核糖核蛋白復合物RNP或mRNA-gRNA組合，以增強CRISPR-RfxCas13d系統在斑馬魚中的效果。i) 使用化學修飾的gRNA（cm-gRNA），以獲得更顯著的基因功能缺失表型；ii) 改進核RNA靶向； iii) 比較不同的計算模型，并確定最準確的模型來預測體內gRNA活性。此外，研究發現除靶向豐富和異位表達的RNA之外，瞬時CRISPR-RfxCas13d可以有效減少斑馬魚胚胎中的內源性mRNA，而不會誘導旁切效應。最后，通過實現替代RNA靶向的CRISPR-Cas系統，如CRISPR-Cas7-11、CRISPR-DjCas13d。
總之，這些發現通過瞬時方法優化了斑馬魚中RNA靶向的CRISPR-Cas技術，對更好地理解和增強斑馬魚中的CRISPR-Cas技術做了重要貢獻，也將促進RNA靶向CRISPR-Cas更有效地應用于生物技術及醫學研究。
03、研究結果
1. CRISPR-RfxCas13d向導RNA優化，在斑馬魚胚胎中實現簡單、持續的靶向作用
在斑馬魚胚胎發育中，CRISPR-RfxCas13d對靶向內源性和早期轉錄的mRNA表現出較高活性，但當受精后7-8小時后，其基因表達效率較低。通過靶向斑馬魚胚胎中不同內源性的mRNA和合子轉錄mRNA，可視化并量化基因功能缺失表型（圖1B–G），實驗結果表明，化學修飾的cm-gRNA與RfxCas13d mRNA聯用，能顯著提高CRISPR-RfxCas13d對斑馬魚胚胎發育后期（7-8 hpf后）表達的合子基因mRNA的敲降效率和表型外顯率，克服了RNP復合物在此方面的不足。
圖片圖1 斑馬魚胚胎中CRISPR-RfxCas13d的靶向作用
此外，進行體外轉錄（IVTed gRNAs）時，觀察到一部分RfxCas13d在斑馬魚胚胎中引起發育遲緩、死亡等嚴重的發育毒性，一些經靜脈注射的RfxCas13d gRNA可能會在體外和體內誘導28S rRNA斷裂，這與胚胎生成過程中的嚴重缺陷和毒性有關。
為了探究毒性效應是源于體外轉錄合成還是gRNA序列本身，研究人員使用靶向mRNA的化學合成gRNA1和gRNA3進行實驗，發現相同序列的化學合成gRNA無毒且有效，揭示了該毒性源于IVT過程本身，而非gRNA序列本身，也非5'三磷酸或干擾素反應。本研究開發了一種簡單快速的體外rRNA完整性檢測方法，通過使用化學合成的gRNAs 或對IVTed gRNAs，可用于預篩IVTed gRNA的潛在毒性。
圖片圖2 體外轉錄的gRNA會引起毒性效應
2. 在斑馬魚胚胎中增強CRISPR-RfxCas13d對核RNA的耗竭
高效的核RNA靶向對消除細胞區域中的RNA至關重要，如長鏈非編碼RNA或微小RNA（microRNA）。為了提高核RNA的靶向能力，研究人員對RfxCas13d進行了優化，帶有核定位信號（NLS，RfxCas13d-NLS）的RfxCas13d在斑馬魚胚胎中的活性大幅降低。
通過測試4種不同的NLS組合，研究人員確定了在RfxCas13d C端添加SV40-核質蛋白長NLS（RfxCas13d-2C-NLS）的mRNA-gRNA遞送方案，能有效靶向并敲降斑馬魚胚胎中的核RNA，如初級miR-430轉錄本pri-miR-430和snRNA u4atac，并引發預期的發育表型和分子效應，如miR-430靶標mRNA穩定化等。
總之，實驗結果表明，作為mRNA-gRNA制劑使用的CRISPR-RfxCas13d-2C-NLS系統能有效耗竭斑馬魚胚胎中的核RNA，優化核定位可以增強對核RNA的靶向和降解作用。
圖片圖3 優化的定位信號增強CRISPR-RfxCas13d核RNA靶向能力
3. 基于體外計算模型可預測體內CRISPR-RfxCas13d活性
最近基于RfxCas13d 和gRNA在哺乳動物細胞培養中的數據，開發了幾種計算模型來預測CRISPR-RfxCas13d活性。為了驗證gRNA活性預測模型的效果，研究人員基于RNP復合物的優化瞬時方法，在斑馬魚胚胎中系統評估了約200個gRNA的體內活性。
實驗結果顯示，RNAtargeting能以與對照組的體外數據相似甚至更高的準確度分類八組gRNA中的五組，且RNAtargeting是區分高效（每組前5名）和低效（每組后5名）gRNA的最有效計算模型（圖 4C–E）。這些結果表明，RNAtargeting是目前選擇高效gRNA的最有用工具。然而，RNAtargeting在預測CRISPR-RfxCas13d RNP活性方面，八組gRNA 中有三組的活性預測準確性較低。
這表明，盡管在部分gRNA組中表現不佳，但RNAtargeting模型在預測和分類CRISPR - RfxCas13d 核糖核蛋白（RNP）復合物活性方面表現最佳，是適度、準確地預測CRISPR - RfxCas13d在體內活性的最佳工具。
圖片圖4：基于體外計算模型可以適度預測CRISPR-RfxCas13d在體內的活性
4. CRISPR-RfxCas13d靶向內源性mRNA的附帶活性
CRISPR-RfxCas13d誘導的附帶活性導致不同的分子結果，從而引起在特異性靶向外源和內源轉錄本后RNA的失控消除，且其附帶活性在靶向高表達基因時最嚴重，并最終導致細胞毒性、細胞增殖減少和28S rRNA斷裂等。
研究人員發現，當使用RNP或mRNA-gRNA瞬時遞送的CRISPR-RfxCas13d系統，靶向高濃度的報告基因，如綠色熒光蛋白GFP的mRNA 時，會引發附帶活性，導致胚胎發育缺陷、28S rRNA 裂解以及轉錄組的全局失調。
但當靶向斑馬魚胚胎中的內源性mRNA時，即使是高豐度內源性基因，CRISPR-RfxCas13d的附帶活性也極小，僅引起極輕微的28S rRNA斷裂，未觀察到發育缺陷或顯著的轉錄組全局失調，表明其具有高度特異性，其附帶活性沒有明顯的生理影響。然而，靶向注射的高豐度外源報告mRNA (gfp mRNA) 時，會觸發劑量依賴性的附帶活性，導致28S rRNA斷裂、共注射報告基因（DsRed）的非特異性敲降、嚴重的轉錄組全局失調，如大量基因上調、下調等，以及發育缺陷、死亡，且這種效應在RNP遞送時更嚴重。
值得注意的是，即使在最低濃度的gfp mRNA中，盡管在敲降（KD）后未觀察到發育延遲，但仍可以明顯觀察到28S rRNA的斷裂，這表明體外RNA完整性檢測在檢測CRISPR-RfxCas13d誘導的附帶活性時非常敏感。
總之，實驗結果表明，即使在斑馬魚胚胎發育過程中靶向高豐度的內源性mRNA時，作為RNP或mRNA-gRNA復合物使用的CRISPR-RfxCas13d的副作用也是極小的，沒有生理影響，但當靶向高豐度外源報告mRNA，如注射報告基因時，就會觸發劑量依賴性的附帶活性。
圖片圖5 CRISPR-RfxCas13d靶向斑馬魚胚胎內源性mRNA的附帶活性
5. 體內瞬時RNA靶向的替代CRISPR-Cas系統
盡管在靶向內源性mRNA時其附帶活性較小，但某些情況下，RfxCas13d引發的附帶活性仍可能會影響其在體內的應用。因此，研究人員對RNA靶向的CRISPR - Cas7 - 11、CRISPR - DjCas13d 和高保真版本的 RfxCas13d（Hf - RfxCas13d）等CRISPR-Cas系統進行了評估。
研究結果顯示，CRISPR-DjCas13d (RNP)在靶向效率上與RfxCas13d相當，但在靶向超高豐度外源gfp mRNA時，引起的發育缺陷、DsRed敲降等附帶活性低于RfxCas13d，且未檢測到28S rRNA斷裂。在本研究條件下，其IVTed gRNA未顯示毒性；CRISPR-Cas7-11 (RNP)幾乎檢測不到附帶活性，無發育缺陷、無28S斷裂、無DsRed敲降、無顯著轉錄組失調，但其靶向效率低于RfxCas13d和DjCas13d。而RNP或mRNA-gRNA注射的CRISPR-HF-RfxCas13d，在瞬時遞送條件下效率顯著低下，不適用于此場景。
總之，實驗結果表明：(i) CRISPR-RfxCas13d 是一種高效、特異且可靠的測試斑馬魚胚胎靶向內源性mRNA的方法；(ii) CRISPR-Cas7-11和CRISPR-DjCas13d RNP可以作為替代系統使用，它們在靶向極豐的異位RNA時，表現出略低于或與 CRISPR-RfxCas13d相似的靶向活性，且附帶活性較低或不存在。
圖片圖6 體內瞬時RNA靶向的替代CRISPR-Cas系統
04、編者點評
本研究通過多種優化策略，如cm-gRNA、NLS組合優化、IVTed gRNA毒性篩查、RNAtargeting模型預測、替代系統等，顯著增強了CRISPR-Cas13d，特別是RfxCas13d在斑馬魚胚胎模型中瞬時靶向RNA的效率、特異性和安全性。而且，揭示了在靶向內源mRNA、瞬時遞送等生理相關條件下，CRISPR-RfxCas13d的附帶活性極低且無生理影響，為規避潛在毒性、核靶向、效率預測等問題，尋求更低附帶活性的替代方案DjCas13d, Cas7-11提供了實用指南。
作為健康美麗產業CRO服務開拓者與引領者、斑馬魚生物技術的全球領導者，環特生物搭建了“斑馬魚、基因編輯、類器官、哺乳動物、人體”等多維生物技術服務體系，開展健康美麗CRO服務、科研服務、智慧實驗室搭建三大業務。目前，環特已建立200多種斑馬魚模型，胃癌、腦類器官、心臟類器官及各種腫瘤類器官培養平臺，歡迎有需要的讀者垂詢！