加州理工學院Viviana?Gradinaru團隊之前開發了AAV變體，例如AAV-PHP.eB，其在嚙齒動物中可通過靜脈注射有效穿越血腦屏障，對大腦細胞具有廣泛靶向性。她的團隊還開發了一些具有細胞類型特異性靶向的AAV變體，例如PHP.V1，其可通過靜脈注射穿越血腦屏障，對大腦內皮細胞具有更強的靶向，但也會靶向星形膠質細胞和神經元，此外，PHP.V1需要細胞類型特異性啟動子，其大尺寸限制了用來遞送基因時的選擇，并且僅在某些小鼠品系中起作用。

基于AAV的基因遞送還面臨一個問題——難以重復給藥，第一次給藥后誘導產生的中和抗體可能會導致重復給藥的AAV被中和。這就需要在第一次給藥時盡可能地提高治療效果。作為最主要的體內基因治療遞送載體，AAV載體已被用于遞送多種基因以治療不同類型的疾病。一種對大腦脈管系統具有特異性靶向的AAV將為基因治療提供新的策略。這是因為脈管系統在大腦中廣泛分布，且與中樞神經系統內的其他細胞類型接近。因此，AAV靶向大腦脈管系統可以作為中樞神經系統更好的生物工廠，用來表達治療性蛋白，以治療中樞神經系統疾病。在這項新研究中，研究團隊通過定向進化和半理性工程設計，確定了一個基于AAV的家族，包括AAV-X1和AAV-X1.1，它們能夠在小鼠體內特異性和有效地靶向大腦脈管系統內皮細胞。下面，讓我們一起來簡讀一下Viviana Gradinaru團隊的杰作：Functional gene delivery to and across brain vasculature of systemic AAVs with endothelial-specific tropism in rodents and broad tropism in primates.

?

AAV面臨幾大挑戰：1.如何有效的穿過血腦屏障，AAV-PHP.eB已經解決^[1]；2.靶向的精準性？腦內皮細胞，可以選擇AAV-BR1這個血清型，但是除了內皮細胞外，也會轉染大量神經元和膠質細胞^[2]；3.AAV在不同物種間存在轉染效率的差異，所以在臨床轉化的過程中，將AAV在非人靈長類動物(NHPs)中的在體實驗納入到整體實驗進程中是必要的；4.AAV二次給藥，會被抗體中和，而且單次、大劑量的AAV，毒副作用也相應增加。所以帶著這些問題，我們一起來看一下Viviana Gradinaru團隊的解決方案。

Result 1:新型AAV系統性注射后，特異性靶向小鼠腦內皮細胞

作者在AAV9的588-589堿基中插入小分子多肽（7個氨基酸），并將得到的病毒文庫靜脈注射到表達來自Tek(靶向內皮細胞)啟動子的Cre轉基因鼠中。經過兩輪篩選，篩出了AAV-X1，為了比較新血清型間的差異，作者將單鏈AAV中，包裝了廣譜啟動子CAG和EGFP，四種血清型分別為AAV-X1、AAV9、AAVPHP.V1、AAVBR1，尾靜脈注射劑量為3E+11vg/只。標記效率比較結果顯示：①AAV-X1在皮層、海馬和丘腦中轉導了約65-70%的GLUT1+(內皮標志物)細胞；②AAV-PHP.V1和AAV-BR1轉導了約40%的GLUT1+細胞；③AAV9轉導了約1%的內皮細胞。特異性結果顯示：95%被AAV-X1轉導的細胞為GLUT1+。相比之下，AAV-BR1和AAV-PHP.V1轉導的GLUT1+細胞特異性要低得多，分別只有60%和40%的轉導細胞是GLUT1+。AAV-BR1也靶向神經元，而AAV-PHP.V1也靶向神經元和星形膠質細胞。綜上所述，與親本載體AAV9相比，新載體AAV-X1不僅對中樞神經系統的靶向性有顯著提高，而且對腦內皮細胞具有較高的特異性。

Result 2: 通過進一步的工程Cargo對X1的外周嗜性進行半理細化

?

AAV-X1展現腦內皮細胞極高的轉導效率的同時，也保持了相似的肝臟轉導水平（Figure 2A）。MicroRNA-122?(miR122)對肝臟具有高度特異性，其干擾靶點已被證明可降低肝臟中AAV的表達^[3]，于是作者將miR122的3個干擾靶點，串聯（miR122TS）構建在AAV-X1-CAG-EGFP中，尾靜脈注射后3周，觀察結果顯示：AAV-X1-CAG-miR122TS-EGFP，在肝臟中表達明顯降低（Figure 2B）。進一步，作者將AAV-PHP.eB中，452-458的小分子多肽（7個氨基酸），插入到AAV-X1，構建了載體AAV-X1.1、AAV-X1.2、AAV-X1.3；此外，作者將AAV-X1中的N272或W503突變為丙氨酸，產生AAV-X1.4和AAV-X1.5，將AAV-X1中的S386突變為丙氨酸，產生AAV-X1.6。

?

Result 3: X1載體以不依賴ly6a的方式在不同小鼠品系和大鼠之間轉導腦內皮細胞

作者前期的研究結果顯示：AAV-PHP.eB與Ly6a結合，可以增加中樞神經系統的嗜性，并且Ly6a在小鼠品系之間的多態性有助于其品系特異性表型。為此，作者想探究AAV9-X1的CNS靶向性是否也依賴與Ly6a結合，測試結果顯示：PHP.eB和PHP.V1表現出與Ly6a的強結合，解釋了PHP的菌株特異性表型;而X1和X1.1均未結合Ly6a(Figure 3A)。這些結果表明X1及其衍生物利用了一種新的細胞靶向機制。

?

接下來，作者測試了AAV9-X1.1-CAG-tdTomato，在成年Listar大鼠中的遞送效率，觀察到載體在大鼠腦中強勁表達(Figure 3D)。復染Glut+后，證明AAV9-X1.1在不同物種間是保守的(Figure 3E)。

?

Result 4: 將X1的血清型從AAV9轉換為AAV1，可以在小鼠中重復給藥

某些應用需要重復遞送AAV，首次給藥產生的中和抗體，會影響二次給AAV的遞送效率。為了解決這一問題，作者給出的策略是更換血清型，鑒于AAV-PHP.eB和AAV9-X1都是基于AAV9改造的，所以為了克服潛在的免疫障礙，作者將PHP.B血清型中的小分子多肽（7個氨基酸）構建到AAV1中：AAV1-PHP.B(Figure 4B),與AAV1相比，AAV1-PHP.B并沒有明顯的靶向性，然而相同的策略，作者將小分子多肽（7個氨基酸）肽插入到AAV1-X1中，AAV1-X1同樣顯示出強大的腦血管內皮靶向性（Figure 4C）。

為了測試AAV1-X1重復給藥的潛力，且增加中樞靶向性，作者將AAV1-X1-Ly6a或AAV1.1-X1-Ly6a，注射到CBA/J小鼠中，表達3周后，再次將AAV-PHP.eB-CAG-EGFP注入相同小鼠。結果顯示注射了AAV1-X1: CAG-Ly6a的CBA/J小鼠大腦中的EGFP表達增加，而注射了X1.1: CAG-Ly6a的小鼠則沒有，說明AAV1-X1激活的血清型轉換模式可能為小鼠的AAV再給藥提供了潛在的解決方案。

?

Result 5: X1.1載體可以將腦內皮細胞轉化為一個生物工廠，用于將分泌的蛋白質輸送到大腦

?

血管在腦區各個角落的分布，使腦血管內皮細胞稱為“生物工廠”成為可能。

SPARCL1/Hevin基因的下調或錯義突變在許多神經系統疾病中都有報道，如自閉癥、精神分裂癥和抑郁癥。在發育中的小鼠視覺皮層中，Hevin對于丘腦皮質連接的形成和可塑性是特別需要的。Hevin基因敲除小鼠(Hevin KO)在出生后的前三周和成年后都表現出明顯的谷氨酸偶體轉運蛋白2陽性(VGluT2+)丘腦皮質突觸的缺失(Figure 4E)。為了確定腦內皮細胞異位表達Hevin是否可以挽救Hevin-KO小鼠的缺陷，作者使用AAV9-X1.1-CAG-Hevin-EGFP的載體，尾靜脈注射Hevin-KO小鼠，3周后，結果顯示：在腦內皮細胞中，Hevin蛋白穩健而特異性的表達(Figure 4F)。結果表明，由腦內皮細胞產生和分泌的Hevin能夠模擬內源性Hevin功能，挽救Hevin-KO小鼠嚴重缺乏的丘腦皮質突觸形成。因此，該系統說明了Hevin相關疾病的潛在治療策略。

?

Result 6: X1載體家族在體外有效地轉導人腦內皮細胞

AAV9-X1感染內皮細胞(HBMECs)在MOI為3*104時，X1轉導了42%的HBMEC，比親本AAV9高180倍。進一步設計的版本X1.1和X1.2分別轉導了44%和53%的HBMEC。

?

Result 7: X1.1有效地轉導體外培養的獼猴和人腦切片

AAV9-X1在HBMECs中的強大表現促使我們研究它們在系統中的功效，該系統可能更好地模擬非人靈長類動物體內條件。因此，作者轉向體外腦切片培養系統（Figure 5B）。這些切片是從靈長類動物（長尾獼猴，Macaca Nemestrina）的大腦中新鮮提取的，并在體外培養。

7-10天后，我們從組織中提取DNA和RNA，并使用下一代測序(NGS)計算組織中AAV庫中變體的富集程度。與AAV9相比，X1.1的DNA和RNA分別增加了4倍和25倍。值得注意的是，在離體腦切片中，X1.1誘導的蛋白表達主要見于神經元。結果說明：X1.1在獼猴和人類離體切片中的強勁表現(Figure 5F)表明，該衣殼在未來的轉化中具有巨大的潛力。

完成了AAV9-X1.1在離體NHP和人腦模型中轉導效率的驗證后，作者進行了猴的體內實驗。作者同時測試了AAV9-CAG-EGFP與AAV9-X1.1-CAG-EGFP，兩種載體在新生恒河猴，每只猴5E+13vg/kg，表達4周后，作者觀察到與AAV9相比，X1.1在包括皮層、舌回(LG)、海馬和小腦在內的大腦區域有較強的表達(Figure 6B)，進一步的免疫組化染色顯示，皮層中約98%的X1.1轉導細胞是神經元，而一小部分靶向細胞是內皮細胞或膠質細胞(Figure 6D、E)。X1.1的神經元轉導比AAV9高約45倍(Figure 6F)。

新生獼猴中X1.1的嗜神經譜與嚙齒動物中X1.1的嗜內皮細胞譜之間的差異開辟了潛在的應用，并強調了跨物種分析AAV載體的必要性。這些實驗表明，新的衣殼AAV-X1.1可以有效地轉導舊大陸猴幼猴的中樞神經系統，使其成為研究神經系統疾病的潛在有用載體。

?

?小 結

本文講解了一款新載體AAV-X1.1，尚未搭配內皮細胞的特異性啟動子的時候，就已經展現出強勁的血管內皮細胞的精準靶向性。后續的吉凱內部測試中，如果新載體AAV-X1.1，搭配上特異性啟動子（TIE或ICAM2），相信會有更好的效果。此外，作者還通過更換血清型，解決了中和抗體，影響AAV二次給藥的難題。

目前吉凱基因正在生產AAV-X1.1的試用裝，內部測試后，將會推廣給老師們使用。

?

[參考文獻]:

1. Chan, K. Y. et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat. Neu- rosci. 20, 1172–1179 (2017).

2.Ravindra Kumar, S. et al. Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types. Nat. Methods 17, 541–550 (2020).

3.sakova, A., Fehlmann, T., Keller, A. & Quake, S. R. A mouse tissue atlas of small noncoding RNA. Proc. Natl Acad. Sci. USA 117, 25634–25645 (2020).