題目：Landscape of submitochondrial protein distribution
期刊：Nature Communications
影響因子：12.353
主要技術：SILAC、線粒體蛋白質組學
研究背景
線粒體是具有雙層膜結構包裹的細胞器，對細胞的能量代謝起著至關重要的作用。據估計，酵母和人類分別含有線粒體內的蛋白約1000種和1500種，分布在四個不同的子區室中。目前已有許多對線粒體細胞器蛋白組學的研究，但是對這些蛋白質在細胞器內的局部定位沒有明確解析。
研究內容及結果
1. 線粒體蛋白質組學圖譜
作者選擇釀酒酵母作為研究對象，使用SILAC定量蛋白質組學技術對釀酒酵母線粒體中可溶性蛋白、外周膜蛋白、整合膜蛋白進行鑒定分析（圖1a）。并使用兩種不同的方法對三類線粒體蛋白進行分類：1. 使用pH11.5的碳酸鹽溶液處理，將線粒體分為膜蛋白（沉淀中，PELcarb）和外周膜＋可溶性蛋白（上清中，SNcarb）兩個組分；2. 超聲處理將線粒體分為膜蛋白（包含內膜和外周膜蛋白，PELson）和可溶性蛋白（SNson）（圖1b）。結果共定量1053種不同的蛋白質，其中805種蛋白質屬于整合膜、外周膜和可溶性蛋白質。作者通過多元混合正態分布統計分析，從每個類別中挑選已知且經過實驗驗證的參考蛋白質進行驗證，數據集中的線粒體蛋白可分為完整的膜蛋白，可溶性蛋白以及界限模糊的四個蛋白組分（圖2a）。WB驗證結果表明該分離組分是可行的（圖2b），最后作者分別鑒定了321個完整的膜蛋白，258個完整的膜蛋白，226個可溶性蛋白和182個模糊蛋白（圖2d）。
圖1 線粒體蛋白質組學
圖2 線粒體蛋白定位
2. 鑒定新的線粒體蛋白質
在數據集中發現鑒定到206個未被SGD數據庫和PROMITO數據庫注釋的蛋白。為了確定這些蛋白是否屬于新的線粒體蛋白或者是來自于未除干凈的其他細胞組分，作者比較了它們在線粒體和完整酵母細胞中的相對豐度（比值）（圖3a），結合WB實驗進行定位，發現比值分為三個區間，<1，1-10，>10。比值小于1則說明，蛋白全部定位在線粒體中，如Sod2、Mdh1和Tom22；比值在1-10之間表明蛋白在線粒體和細胞質中均有分布，如S100和P100；比值大于10 的蛋白則有可能不定位在線粒體中，如Sod1（圖3b）。
為了驗證比值大于10 這部分蛋白究竟是否會進入線粒體中，作者通過體外轉錄/翻譯合成了放射性標記的前體蛋白，并成功地將標記蛋白質導入到分離線粒體中（圖3c）。作者檢測了14種不同的前蛋白，這些前蛋白迄今未注釋為線粒體蛋白，在數據集表現為可溶性或外周膜或模糊蛋白。根據膜電位Δψ結果顯示，所有前蛋白都被導入線粒體（圖3d-f），此外，部分蛋白質在運輸進入線粒體后還進行了進一步蛋白剪切。總之，作者鑒定了迄今為止未劃分到線粒體的206種蛋白質，并且證實了其中14種蛋白的線粒體定位。
圖3 驗證新蛋白質的線粒體定位
3. 整合線粒體蛋白質分布圖
為了進一步完善線粒體蛋白質分布全景圖，作者將上述鑒定的整合膜蛋白分別分配到外膜（OM）和內膜（IM）。此外，作者作者使用公認的OM和膜間隙（IMS）參考蛋白質組推導所有線粒體蛋白質的亞定位?？偠灾湍妇€粒體蛋白分布全景包括236個外周和245個整合的IM蛋白，21個外周和74個整合的OM蛋白，49個IMS和193個可溶性基質蛋白（圖4）。
文章小結
作者首次將線粒體蛋白細分成外膜、膜間質、內膜和基質四個不同組分，結合SILAC定量蛋白質組學技術將818種線粒體蛋白質定位在對應的亞區。此外本文不僅對蛋白在線粒體中的亞定位進行重新區分驗證，并且發現了206個新的線粒體蛋白，提供其在細胞器內特定定位的詳細圖譜。
解析文獻
F.-Nora V?gtle, Julia M. Burkhart, et al. Landscape of submitochondrial protein distribution [J]. Nature Communications, 2017, 8:290.