隨著高通量測序的發展，lncRNA的研究熱度一直居高不下，大量lncRNA得到注釋，其通過在轉錄、轉錄后水平及表觀遺傳方式調控基因的表達，參與機體的生長發育過程。
如NEAT1-1 m6A通過上調Pol II磷酸化促進腫瘤的發生轉移1；GATA6-AS1可作為調節因子影響GATA6的表達，參與內胚層的分化過程2。而對于剛接觸lncRNA的科研小白，要想研究其功能及調控機制，需要了解以下2個關鍵點。
一、lncRNA的敲除和過表達
研究lncRNA對下游靶基因的調控機制時，一定少不了對lncRNA進行敲低、敲除和過表達。敲低lncRNA最常用的做法是利用RNAi降解RNA，實現轉錄后水平的沉默，降低表達水平。如果要在體內敲低某lncRNA時，只需將包裝好的含shRNA序列的病毒感染目的細胞，即可實現lncRNA的敲低3，這種方式對編碼和非編碼基因都適用。
而對于lncRNA的敲除，可以通過Cre-loxp和CRISPR-Cas9 2種系統在基因組水平上編輯實現。Cre-loxp是一種重組酶系統，Cre重組酶能夠特異性識別loxp位點，并將2個loxp位點間的序列進行刪除或重組（詳細Cre-loxp系統介紹）。
Cre-loxp系統敲除效率高、敲除徹底，但受限于必須有構建好的Flox小鼠（基因組中目的lncRNA 2側插入有同向的loxp位點），然后將構建好的Cre酶工具載體注射到小鼠體內，當Cre酶表達后即可刪除2個loxp之間序列，實現目的基因的敲除。
CRISPR-Cas9系統包含具有核酸內切酶活性的Cas蛋白和單鏈sgRNA（single-guide RNA），sgRNA通過識別基因組序列，引導Cas9蛋白切割基因組，當DNA雙鏈發生斷裂后，細胞主要通過（NHEJ）非同源末端連接修復斷裂口，因此會引入小片段堿基的插入。
對于編碼基因，非3倍數堿基的插入會導致移碼突變，實現編碼基因的敲除，但這種移碼突變對lncRNA達不到任何敲除效果。
要想敲除lncRNA，則需要在基因組上lncRNA上下游各設計2個sgRNA對，串聯構建至Cas9載體上包裝病毒，Cas9蛋白表達即可切除基因組DNA，達到lncRNA敲除的目的（Cas9系統對lncRNA敲除效率及影響敲除效率的因素詳見《高效篩選低陽性比例單克隆技巧｜CRISPR/Cas9敲除LncRNA或者外顯子的效率是多少？》）。
常規過表達lncRNA，只需將目的序列構建至載體中轉染細胞即可實現。但對于長度超出載體容量的基因，則需要利用CRISPR-SAM系統，通過失去核酸內切酶活性的dCas9和sgRNA靶向作用，將轉錄激活因子P65/HSF1/VP64拉到基因啟動子區，實現基因的內源性過表達。此外，saRNA技術也能上調基因的過表達（詳見《有了這三項技術，90%以上的『基因過表達』可以實現》）。
二、確定lncRNA與蛋白結合的功能區
lncRNA與蛋白的互作是調控機制研究的主流。由于lncRNA長度大于200nt，它不像miRNA一樣可以通過種子區調節靶基因的表達。所以，確定lncRNA的功能區域是研究RNA-蛋白互作機制的要點。
在2020年Genome Biology發表的“A novel antiviral lncRNA EDAL shields a T309 O-GlcNAcylation site to promote EZH2 degradation”文章中，lncRNA EDAL通過抑制組蛋白甲基轉移酶EZH2 T309位的O-GlcNAc糖基化，使EZH2降解并抑制狂犬病毒的復制4。該作者研究EDAL功能區及其在EZH2上作用位點的方法值得大家借鑒。
為了研究EDAL的功能區，作者將RNAstructure 5.3預測到的EDAL二級結構分4個小區段驗證（A），結果發現EDAL–1(1-304nt)能夠降解EZH2，并降低病毒滴度(B)。
接著缺失EDAL–1不同區段進行過表達，發現只有98-153nt組產生同樣結果。進一步將該段構建至其他lncRNA 3’端進行相同實驗，同樣也降低了EZH2表達，因此作者確定了EDAL-1是誘導EZH2降解的關鍵功能區。
為了進一步驗證EDAL與EZH2的作用位點，作者突變了影響EZH2穩定性的磷酸化和O-GlcNAc位點，通過一一排除并結合pull-down、WB等驗證出EDAL通過與EZH2 T309 O-GlcNAc位點作用，促進EZH2降解。
由于生物分子的功能與結構是密切相關的，像該文中作者將lncRNA根據二級結構截短、缺失并進行過表達驗證，無疑是確定lncRNA功能區段的。同時，也可以結合RNA-pull down及RIP技術，通過對形成的RNA-蛋白復合物分離、純化及檢測，最終證實lncRNA與蛋白的互作。
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參考文獻…
1. Wen S, et al. Long non-coding RNA NEAT1 promotes bone metastasis of prostate cancer through N6-methyladenosine. Molecular Cancer, 2020(171)
2. Yang et al., GATA6-AS1 Regulates GATA6 Expression to Modulate Human Endoderm Differentiation. Stem Cell Reports, 2020
3. Zhu B L, et al. MMP13 inhibition rescues cognitive decline in Alzheimer transgenic mice via BACE1 regulation. Brain, 2019, 142(1): 176–192
4. Sui B, et al. A novel antiviral lncRNA EDAL shields a T309 O-GlcNAcylation site to promote EZH2 degradation. Genome Biology, 2020, 21(1): 228