編者按

食品安全一直是人們關注的領域。選擇穩定、高效的模式生物對食品毒理學研究尤為重要。斑馬魚是小型脊椎模式動物，與哺乳動物模型相比具有生命周期短、繁殖能力強、飼養方便、成本低等特點，其基因與人類有70%的同源性。斑馬魚胚胎透明易觀察，且具有對環境敏感的優點，因此被用作生物傳感器。斑馬魚及其胚胎已被廣泛應用于食品毒理學評估。

今天，我們分享2023年7月由湖北師范大學劉細霞副教授團隊、中國農大許文濤教授合作發表在國際食品頂刊《Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety》（JCR Q1，中科院一區TOP期刊，IF 14.8）的一項研究成果——Zebrafish as model organisms for toxicological ev

aluations in the field of food science，該研究系統而全面地總結了以斑馬魚為模式生物的食品毒理學研究，主要內容包括：食品毒理學評價的多維機制和構效關系研究；根據食品中的八種危害物類型對相關研究進行了分類，包括真菌毒素、農藥、抗生素、重金屬、內分泌干擾物、食品添加劑、納米顆粒和其它與食品有關的成分；對斑馬魚在食品毒理學研究中的應用進行了展望，以期為食品科學領域的研究人員提供有價值的參考。

文章題目

Zebrafish as model organisms for toxicological evaluations in the field of food science

雜志：Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety（JCR Q1，中科院一區TOP期刊，IF=14.8）

發表時間：2023年7月

作者：劉細霞，許文濤，侯瑩鈺等

單位：湖北師范大學食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室；中國農業大學

項目資助：由湖北省教育廳科學研究計劃重點項目（D20222503）、食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室開放基金（EWPL202103）、湖北師范大學國際化項目庫（HBNUIP-20220302L）、湖北省教育廳科學研究計劃項目（Q20212503）、湖北省高等學校優秀中青年科技創新團隊計劃（T2022028）等項目資助。

01、研究結論

1.  許多研究已經描述了食品中的大多數化學危害物單一物質的毒性作用，包括氧化應激的誘導、發育毒性、行為毒性或器官毒性等。由于人們在日常生活中經常接觸到有毒物質的混合物。因此，出現了越來越多的關于類似或不同類型的化學物質的聯合毒性作用研究，并開發出了相應的解毒劑。然而，需要更多的研究來關注遺傳毒性、神經毒性和生殖毒性及其機制。影響和改善單一毒性和聯合毒性的因素仍有待進一步探討。

2. 在大多數研究中，有毒物質是直接添加到水中的，而且斑馬魚在不同發育階段的暴露模式存在差異，這使得研究個體的毒物動力學過程和表型變化的劑量限制變得復雜。此外，斑馬魚對助溶劑濃度和溶液pH值的耐受性有限。對水溶性較差和毒性作用更強的有毒物質進行毒理學研究，需要嚴格選擇適當的發育階段和暴露方法，以獲得穩定和有意義的結果。

3. 斑馬魚胚胎將在食品毒理學評價領域發揮更重要的作用，特別是基于其高通量應用特性的生物標志物篩選，并且可與代謝組學和轉錄組學等其他跨學科研究相結合。

02、研究背景

斑馬魚（Danio rerio）作為一種脊椎動物，被廣泛應用于生命科學領域。其擁有與人類相似的組織器官和系統，基因和信號通路與人類高度保守，且神經發生、軸突發生、神經元亞型特異性方面等與哺乳動物高度相似。與用于毒理學評價的嚙齒類動物相比，斑馬魚具有生命周期短、繁殖力強、飼養成本低的特點。由于其體型小且繁殖率高，利用斑馬魚可以篩選更多樣本，也更有可能檢測到具有生物學意義的反應。

自21世紀以來，斑馬魚在生態學、醫學、環境毒理學等領域得到了廣泛應用（Asharani等人，2011；Jin等人，2018；Li等人，2018；Wang等人，2015）。國際標準化組織（ISO）、經濟合作與發展組織（OECD）、國家標準化管理委員會已頒布20多項斑馬魚用于化學品及環境毒性評價的標準文件，如ISO-15088-2008、OECD 236-2013、《水質物質對淡水魚(斑馬魚)急性毒性測定方法》(GB/T 13267—1991)等，為以斑馬魚作為毒理學評價模式生物奠定了基礎。

食品安全與民生息息相關。在以往的研究中，傳統的毒理學評價是以小鼠（Mus musculus）為研究對象開展的，但小鼠在食品安全研究中存在諸多不足，如實驗周期長、成本高等。近年來，斑馬魚在毒性評價中的應用日益廣泛，被用于評估食品中化學物質的危害及潛在風險，并闡明新的毒性機制等（Gaur等人，2018；Kim等人，2011；Komoike等人，2020）。

此外，斑馬魚胚胎對環境更敏感，能在體外受精后迅速生長，這些特性有助于進行斑馬魚行為分析，并用于發育毒性與致畸性研究等。目前，斑馬魚胚胎已被用作生物傳感器，以快速篩選評價大批量化學物質的生物活性及其毒性（Noyes等人，2015）。然而，在評價不同物質的毒性時，斑馬魚與哺乳動物之間的差異不容忽視（Bambino & Chu，2017）。因此，需要進一步研究以確定斑馬魚是否適用于食品毒理學評估（Focker等人，2022）。

本文綜述了以斑馬魚為模式生物的食品毒理學研究，包括真菌毒素、農藥、抗生素、重金屬、內分泌干擾物、食品添加劑、納米顆粒和其它與食品有關的成分；以及食品毒理學評價的多維機制和構效關系研究等，并對斑馬魚在食品毒理學研究中的應用進行了展望，以期為食品科學領域的研究人員提供有價值的參考。

03、斑馬魚在毒理學評價中的應用

1.  利用斑馬魚建立多維度毒性評價機制

通過斑馬魚表型、生物標志物、代謝途徑、生理及遺傳毒性效應等多維度評價機制，可以對食品中存在的化學危害進行毒理學評價。

就胚胎表型而言，斑馬魚透明、可觀察，其早期胚胎透明，又是在體外生長發育，可以通過顯微鏡很好地觀察胚胎各個時期的發育狀況。根據斑馬魚在暴露一段時間后表型的變化，如發育異常(體長改變、卵黃囊吸收延遲)、畸形(脊柱彎曲、心包水腫、肝組織形態受損)和行為異常等，可以對化學品的毒性進行評價。

近年來，利用斑馬魚開展毒性評價的研究逐年增加，自2019年以來已發表超過5000篇，其中約8%與食品成分/化學品相關，涉及氧化應激、炎癥反應、肝毒性、腎毒性、心臟毒性、神經毒性、生殖毒性及遺傳毒性等相關研究，并進一步闡明了其作用機制（見表1）。

表1 利用斑馬魚闡明毒性效應及其相關機制

利用斑馬魚開展多維度毒性評價已被應用于食品安全領域，不僅提高了研究效率，降低了研究成本，還避免了動物福利問題等（Cassar等，2020）。

2. 以斑馬魚為模型生物的毒理學評價結構-活性關系研究

通過斑馬魚模型來研究化學物質的結構與其毒性效應之間的關系，可以為闡明不同濃度物質的毒性效應差異、毒性機制探索和風險評估提供依據。已有研究表明，在化學物質中，如頭孢菌素、1,2,4-三唑、無機納米材料、雙酚類化合物等，斑馬魚的結構-活性關系研究表現出色?；诎唏R魚胚胎構建的食品劑量-反應和構效關系模型，對開展食品毒性評價具有重要意義。

04、斑馬魚在食品毒理學評價中的研究進展

1.  霉菌毒素

霉菌毒素是谷物或飼料中霉菌生長產生的有毒代謝產物，目前，人們已發現了數百種霉菌毒素，這些毒素在動物體內有不同的毒性、代謝途徑和靶器官，是最危險的食品污染物之一。為了建立食品殘留限量標準，研究每種霉菌毒素的毒理學機制至關重要。

以往的研究結果顯示，霉菌毒素在斑馬魚中會引起不同類型的毒理學效應，如行為異常、致畸性、發育毒性和肝毒性等。在表2和圖1中，研究人員總結了霉菌毒素對斑馬魚及其胚胎的毒理學效應。大多數結果集中在霉菌毒素中單一毒素毒性的研究上。

表2 霉菌毒素對斑馬魚的毒性效應

圖1  黃曲霉素對斑馬魚的毒性效應

研究表明，暴露于黃曲霉素B1(AFB1)的斑馬魚胚胎，其代謝特征與哺乳動物顯示的肝毒性一致，且在與人類不良后果相關的濃度下觀察到了致畸作用。

此外，Wu等人(2019)發現，在6 hpf-15dpf期間，將斑馬魚胚胎暴露于濃度為15-75ng/mL的AFB1時，斑馬魚表現出神經發育異常，且神經毒性標志物(如gfap和huC)水平發生改變；將斑馬魚暴露于AFB1或赭曲霉毒素A時，會抑制與人類糖尿病相關的兩個關鍵轉錄因子hhex和prox1的表達，且治療組表現出肝毒性。

除單一毒素效應外，研究還報道了兩種或三種毒素共同暴露的毒性效應，Juan-Garcia等人(2021)研究了真菌毒素棒曲霉素、棒曲霉素A和棒曲霉素B在二元或三元混合物中的聯合毒性

除了單一毒素效應外，研究還報告了兩種或三種毒素的共同暴露毒性效應（Juan-Garcia 等人，2021；Wang, Wang 等人，2021），所有混合組均表現出發育毒性和行為的改變。

在回顧相關文獻后，我們發現，通過斑馬魚及其胚胎對真菌毒素開展毒理學研究，可以從行為、組織形態深入到分子水平的毒性機制研究，從單一毒素的毒性評估擴展到多種毒素的毒理學研究，但還需要對多種毒性機制進行更多研究，如生殖毒性、心臟毒性等。不同霉菌毒素混合物與其他有毒物質的聯合毒性研究已成為一種趨勢。

2. 農藥

當前，全球農藥市場規模巨大，一些果蔬中農藥殘留超標或超范圍存在屢禁不絕。越來越多的研究利用斑馬魚來探究農藥對斑馬魚生長、發育及其生理活動的影響。

二噁英（dioxins，PCDD/Fs）及二噁英類污染物（DLCs）作為含氯農藥的副產物，是迄今為止化合物中毒性最大且含有多種毒性的物質之一，通過食物攝入會對人類健康產生不利的影響。已有研究表明，斑馬魚胚胎不僅可以被用于研究農藥的毒性，而且在解毒劑的開發中也發揮了重要作用。圖2和表3中總結了斑馬魚在農藥毒性評價中的應用。

圖2 斑馬魚在農藥毒性分類研究中的應用

表3 部分農藥對斑馬魚的毒性效應

由于農藥種類繁多，在日常生活中人們經常同時接觸到兩種或多種農藥的混合物。利用斑馬魚模型進行急性毒性實驗發現，不同組合或不同比例的農藥混合物具有不同的毒性作用；也有研究評價了農藥混合物對斑馬魚主要器官、組織和生理活動的聯合毒性作用，發現相比于單獨暴露于一種農藥中，農藥混合物中的斑馬魚形態缺陷發生率更高，神經元也更大。

除了用于農藥毒性分類、風險評估、聯合毒性評價之外，利用斑馬魚模型也可以用于農藥慢性毒性、農藥在分子水平上的毒性機制研究、不同物質誘導的農藥毒性研究及其機制研究等，對評估、管理和降低農藥風險具有重要意義。

3. 抗生素

隨著社會經濟的發展和人口的增長，人們對食品安全和質量的要求不斷提高，這引發了人們對食品中抗生素存在的擔憂。β-內酰胺類抗生素（β-lactams）、喹諾酮類抗生素、四環素類抗生素、大環內酯類抗生素等被廣泛應用于動物疾病防治和食品保鮮。然而，抗生素等藥物殘留，容易引發耐藥性并最終影響人類健康，因此，成為了廣大消費者關注的焦點問題。

歐盟規定了動物源性食品中不同抗生素的最大殘留限量(NO.2377/90/EC)，但在水體、土壤，甚至很多動物的腸道中都曾檢測到抗生素的殘留，從而影響生活在受污染水體中的魚類。以斑馬魚及其胚胎為模式生物，研究人員系統評估了抗生素的毒性，進一步明確了殘留標準，并探討了其毒性機制（圖3）。

圖3 斑馬魚對不同抗生素的毒性效應

Petersen等人（2021）探究了不同抗生素，即頭孢他啶、環丙沙星和氯四環素對斑馬魚行為的影響；以斑馬魚及其胚胎為模式生物的實驗表明，暴露于磺胺類藥物、四環素類和其他水產養殖中常用的抗生素，會影響斑馬魚胚胎的孵化，產生致畸效應，并損害斑馬魚的腸道健康（Zhou等人，2018）；大環內酯類抗生素會對斑馬魚胚胎造成嚴重的心臟毒性和發育毒性（Yan等人，2019），并對斑馬魚造成肝毒性（Zhang等人，2020）。

與農藥聯合毒性研究相類似，斑馬魚也是研究抗生素聯合毒性的良好模式生物。Zhang等人（2016）研究了氟喹諾酮類、四環素類藥物對斑馬魚胚胎的聯合毒性，發現聯合毒性相當于或略低于單獨使用四環素的毒性，這表明抗生素之間可能存在拮抗作用。

近年來，抗生素毒性研究開始采用跨學科方法或側重于植物源抗生素。Han等人（2018）報告了利用斑馬魚模型結合轉錄組學、ADMET研究來系統評估頭孢菌素的毒性；植物源性天然產物，如多酚類、生物堿類、單寧等，被看作抗生素的替代品或補充劑，以改善細菌的耐藥性問題。然而，這些物質是否具有毒性需要進一步明確，但以往的研究尚集中在利用斑馬魚作為模式生物闡明植物源抗生素的抗菌活性研究。未來，斑馬魚將在研究植物源抗生素的劑量-反應關系及其潛在毒性方面發揮更廣泛的作用。

4. 重金屬

近年來，土壤和工業廢棄物中的重金屬污染物引發了許多食品安全問題。食品中可能含有多種重金屬污染物，如銅、鉻、鎘、鉛、汞等。重金屬具有強累積毒性，且半衰期很長，通過食物鏈中生物富集和生物放大，對人體健康構成潛在威脅。因此，評估不同濃度和組合的重金屬安全風險并闡明其潛在毒性機制，對人類健康至關重要。

研究表明，重金屬對斑馬魚胚胎孵化率、壽命、心率及骨骼發育都有影響（Gouva et al., 2020），斑馬魚在重金屬毒性評價中的應用總結見圖4、表4中。

圖4 斑馬魚在不同重金屬毒理學研究中的應用

表4 一些重金屬對斑馬魚的毒性效應

作為人體必需的微量元素，銅和鉻的攝入不足或過量都會影響健康。在濃度為9微克/升、暴露96小時的情況下，銅對斑馬魚的記憶和行為產生了不利影響（Acosta et al., 2016）；曹等（2019）將斑馬魚暴露于10微克/升的硫酸銅中30天后，發現斑馬魚性腺發育發生改變，類固醇激素水平紊亂，內分泌相關基因表達異常，這些均抑制了斑馬魚的生長與繁殖；鉻對斑馬魚胚胎具有致畸性，喂食被鉻污染的飼料時，斑馬魚形態異常、且存活率下降（Tye et al., 2018）；

鎘對斑馬魚的毒性作用包括免疫毒性、神經毒性、肝毒性及發育毒性、行為毒性等；暴露于重金屬鉛會導致斑馬魚腸道菌群失衡、肝臟代謝紊亂、發育毒性和神經毒性等。陳等（2012）證實，斑馬魚胚胎暴露于鉛會導致畸形，并以劑量依賴的方式改變斑馬魚幼魚的自發運動和行為，導致記憶缺陷；劉等（2016）發現，親代雌性斑馬魚暴露于甲基汞（MeHg）會導致后代形態變化和神經行為功能障礙。

與農藥、抗生素研究類似，研究人員也使用斑馬魚這一模型生物來研究重金屬混合物的毒性作用（Liao et al., 2021）。高等（2018）探討了鎘、鉛和銅的聯合毒性，發現銅-鎘、銅-鉛對斑馬魚的聯合毒性具有協同作用。

斑馬魚還被用于探究重金屬與農藥、抗生素及其他非金屬化合物的聯合毒性；解毒物質的研發及其作用機制的研究等，預防和控制食品中的重金屬污染并對其進行標準化尤為重要。未來，斑馬魚將進一步在多種重金屬和非金屬物質的聯合毒性機制研究及解毒物質的開發中發揮關鍵作用。

5.  內分泌干擾物

內分泌干擾物（EDCs），又稱環境激素，是影響人體、動物體內正常激素水平，破壞內分泌系統的一類外源性化學物質。殺蟲劑、塑料及藥物等的一系列產品中均含有EDCs，它們殘留在食物及日常生活環境中，往往通過食物鏈對人體產生不利影響，并進一步影響生態平衡。

通過觀察斑馬魚及其胚胎暴露于普通食品中殘留EDCs的生理指標和結構變化，可以進一步研究EDCs對人類生理過程的影響。以斑馬魚為模型生物，對食品中常見EDCs的毒性研究總結見表5。

表5 斑馬魚對某些內分泌干擾物的毒性效應研究

長期暴露于BPA及其類似物中的斑馬魚，可能引起行為障礙、腎臟疾病、生殖毒性等。表5簡要概述了常見EDCs及其混合物引起的神經行為障礙、代謝紊亂、甲狀腺功能異常等毒性作用?；贓DCs的毒性評估，斑馬魚及其胚胎經常被用作評價化合物內分泌干擾作用的模型生物，后續將進一步探究其相關機制和方法。

6.  食品添加劑

食品添加劑是化學合成或天然物質，如色素、防腐劑和甜味劑，它們被添加到食品中，用以改善食品的質量、顏色、香味和口感等，從而滿足食品保鮮、加工的需求。盡管許多食品添加劑的安全性已得到證實，但近年來由食品添加劑引起的食品安全問題逐漸顯現，引起了越來越多研究人員的關注。因此，利用斑馬魚這一模型生物來研究食品添加劑毒性作用的研究數量有所增加。

食品添加劑對斑馬魚的毒性作用主要表現為發育毒性、心臟毒性、生殖毒性等。用斑馬魚胚胎評估檸檬黃、日落黃、莧菜紅和誘惑紅等4種偶氮染料的發育毒性發現，當濃度為5mM（低于ADI，7.5 mg/kg體重）時，未出現明顯的畸形，而當濃度高于ADI時，斑馬魚胚胎出現了孵化困難、發育異常等。除此之外，焦糖色素E150d以劑量依賴的方式對斑馬魚胚胎的孵化、存活、表型及心跳產生毒性作用，并導致骨骼肌、心包破損傷等（Capriello et al., 2021）；還有研究發現，食品添加劑京尼平對斑馬魚胚胎具有發育毒性，會導致心包水腫，并可能在斑馬魚中引起心臟毒性、肝毒性、腎毒性等（Xia et al., 2021）；

人工甜味劑，如阿斯巴甜（APM），在高脂飲食中可進一步誘發毒性；Kim等人（2011）發現，在高脂血癥存在的情況下，APM對斑馬魚存活率的負面影響比糖精（SAC）更大，并會導致運動能力下降、腦炎癥增加；Han等人（2021）和Li等人（2021）對斑馬魚的全面神經行為特征進行了表型分析，并系統地描述了SAC和APM的潛在行為和神經毒性作用，如圖6所示。

圖6 人工甜味劑對斑馬魚神經行為表型的影響

食品中防腐劑的毒性也引起了食品安全的關注。Pradhan等人（2020）發現，乙氧喹改變了參與應激反應、細胞周期和DNA損傷途徑的基因表達水平，從而導致斑馬魚發育性神經毒性和運動缺陷；Huang等人（2021）發現，斑馬魚暴露于50 mg/L的脫氫乙酸鈉，可導致心腦血管損傷，且通過在斑馬魚中誘導Ca2+和維生素D3缺乏，可進一步導致心肌細胞中Ca2+依賴的線粒體損傷。食品添加劑的毒性作用和研究結果見表6。

表6 一些食品添加劑對斑馬魚的毒性效應

因此，需要基于斑馬魚進一步研究食品添加劑的毒性，后續可以更多地關注食品添加劑在分子水平上的毒性機制及其混合物對腎、肝、心血管、神經系統的影響。

7. 納米顆粒

隨著納米技術的發展，納米顆粒由于其獨一無二的特性，如增強食品風味、顏色、穩定性及抗菌活性等，被用作食品抗菌包裝膜、食品添加劑，在食品領域日益流行。通過飲食攝入納米顆粒，對人類健康的潛在威脅已引起研究人員的關注。

本文回顧了過去十年中單一納米顆粒毒性作用及與其他物質聯合毒性作用的研究。有研究發現，斑馬魚暴露于一定劑量的金屬或非金屬納米顆粒會導致腦毒性、內源微生物群紊亂、生殖毒性、致畸形等（表7）。

表7 某些納米塑料對斑馬魚的毒性效應

此外，以斑馬魚為模型生物，研究人員還探究了毒性誘導機制及解毒物質；納米顆粒的毒性還可能與其形態有關，且可能與其他有毒物質，如重金屬相互作用。因此，應開展更多實驗，對斑馬魚納米顆粒毒性作進一步研究。

8. 其他與食品相關的成分研究

除上述各種污染物外，食品中還存在著許多內源性物質，如黃酮類化合物、咖啡因和乙醇，其對人類健康的影響尚不清楚，值得深入研究。這些物質通過飲食自然攝入，具有高度的暴露潛力和生物活性，可以使用斑馬魚進行相關毒性研究。

黃酮類化合物是廣泛存在于谷物、果蔬中的多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用，但研究表明，其可能導致生殖毒性（Jefferson等人，2005）。

除黃酮類化合物外，當斑馬魚胚胎在受精后15-48小時暴露于100和150 mg/L的咖啡因時，其體節間血管縮短變細，血管標記基因的表達也發生了變化（Basnet等人，2021）。其他與食品相關的成分也已通過斑馬魚進行相關研究，以確保食品安全。

05、編者點評

綜上所述，本研究闡述了以斑馬魚為模式生物的食品毒理學研究，包括真菌毒素、農藥、抗生素、重金屬、內分泌干擾物、食品添加劑、納米顆粒和其它與食品有關的成分；食品毒理學評價的多維機制和構效關系研究等，并對斑馬魚在食品毒理學研究中的應用進行了展望。

相信斑馬魚模型將在食品毒理學評估中發揮更大作用，特別是在高通量生物標記物篩選和跨學科研究中。通過斑馬魚模型的研究，我們能夠更快速、更經濟地評估食品中的潛在危害，為食品安全監管提供科學依據，保護公眾健康。讓我們共同關注食品安全，支持使用斑馬魚等創新模型生物進行科學研究，為打造健康飲食環境貢獻力量！

作為健康美麗產業CRO服務開拓者與引領者、斑馬魚生物技術的全球領導者，環特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”多維生物技術服務體系，開展健康美麗CRO服務、科研服務、智慧實驗室搭建三大業務。目前，環特已建立200多種斑馬魚模型，胃癌、腦類器官、心臟類器官及各種腫瘤類器官培養平臺，歡迎有需要的讀者垂詢！