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題目：A time-resolved multi-omic atlas of the developing mouse stomach
期刊：Nature Communications
影響因子：12.353
主要技術：Label-free
研究背景
哺乳動物的胃結構高度多樣化，其器官功能依賴于正常的胚胎發育。盡管已有多項關于胃發育過程中形態學變化的研究，但是大多數胃發育研究都集中在一小組蛋白質或特定途徑上，阻礙了對系統生物學中整個過程的理解，缺乏對潛在分子變化的全系統分析。
研究內容及結果
1. 小鼠胃發育的蛋白質組學圖譜
為了繪制發育中的小鼠胃的蛋白質組圖譜，作者選擇了15個時間點收集小鼠胃樣品，覆蓋胚胎期（E12.5即胚胎第12.5天、E13.5、E14.5、E15.5、E16.5、E17.5和E18.5）、產后天（D1、D3、D5）和產后周（W1、W2、W3、W6、W8），每個時間點3個生物學重復（圖1a）。作者使用Label-free定量蛋白質組學共鑒定到12108種蛋白質。一般而言，管家蛋白，例如TUBB4B和HSP90B1，在整個發育階段表現出穩定的表達，在對數變換后，蛋白質的相對豐度（iFOT）跨越約8個數量級，這反映了胃蛋白質組的高度動態性質（圖1e）。作者選取了2890種蛋白質代表胃蛋白質組的核心組分，這些蛋白質的功能在多種途徑中顯著富集，包括代謝、剪接體、蛋白質加工和其他途徑（圖2）。
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圖1 小鼠胃發育蛋白質組學
圖2 核心蛋白KEGG分析
2. 小鼠胃發育的三個不同階段
蛋白質機制的變化決定了器官發生和發育。雖然整個發展過程是逐漸發生變化的，但在某個關鍵階段會發生顯著變化。為了在蛋白質表達水平上研究這些變化，作者進行了無監督層次聚類分析（HC）和主成分分析（PCA），發現兩種分析方法都將實驗劃分為三個明顯不同的階段：Ph1 （E12.5-E16.5），Ph2 （E17.5-W2）和 Ph3 （W3–W8）（圖3a）。為了鑒定每個階段的代表性蛋白質并了解它們的生物學意義，作者對三個階段的4300個差異表達蛋白進行了蛋白質共表達分析和KEGG分析（圖3b，c）。KEGG分析表明Ph1與細胞分裂有關。Ph1具有最多的差異表達蛋白，主要參與剪接體、RNA轉運、DNA復制、細胞周期和嘧啶代謝等通路途經（圖2c）。Ph2涵蓋圍產期和哺乳期，是胃在形狀和質量上增長最快的階段，Ph2具有最少數量的高表達蛋白質，富含ECM-受體相互作用、溶酶體和粘著斑（圖2c）。Ph3是成熟期，胃已經獲得代謝功能，當嬰兒小鼠斷奶（出生后20-22天）并開始吃食物36時，Ph2和Ph3之間的邊界位于W3。
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圖3 小鼠胃三個發展階段及其生物功能
3. 胃發育過程中關鍵胃蛋白的動態變化
作為主要的消化器官，胃產生許多消化酶，因此，作者追蹤了胃發育過程中三個重要的胃蛋白酶原（CYM、PGA5和PGC）的表達動態變化（圖3d）。CYM和PGA5在Ph2中高度表達，PGC僅在Ph3中檢測到。Ph2中的小鼠以牛奶為食，高水平的CYM和PGA5表明它們可能在乳蛋白消化中起重要作用。W3期檢測到PGC，并且其在W3后維持在高水平，這一發現與已報道的PGC在成人胃中表達結果一致。胃蛋白酶原在胃質子泵產生的酸性環境中被激活，胃質子泵是存在于胃泌酸粘膜壁細胞中的H+/K+-ATP酶，它有兩個亞基（ATP4A和ATP4B），是介導酸分泌的離子傳輸系統的關鍵部件之一。ATP4A和ATP4B的表達水平在Ph2中同時增加并在Ph3中達到峰值（圖3d），標志著隨著小鼠胃成熟，壁細胞在Ph2和Ph3中的形成和成熟。
在胃中高度表達的其他蛋白質（ANXA10、CLDN18、CTSE、GHRL、GIF、TFF1和VSIG1）維持正常的胃功能（圖4）。其中，GIF是由胃主細胞產生的糖蛋白；ANXA10是在胃粘膜中表達的鈣和磷脂結合蛋白；VSIG1是腺體胃上皮細胞正常分化所需的細胞粘附蛋白；CLDN18是胃上皮相關的密蛋白。在發育的Ph3中這些蛋白質的逐漸增加表明它們可能是成熟胃的標志物。
圖4 七種胃蛋白在小鼠胃發育中表達變化
4. 差異表達剪接異構體
基于MS的蛋白質組學分析的同時，作者還在相同時間點的小鼠胃組織上進行高通量RNA-Seq分析，兩個數據集同時鑒定到10994個基因。轉錄組數據的無監督層次聚類分析（HC）和主成分分析（PCA）將整個小鼠胃發育過程分成兩個階段（圖5a）。該分類幾乎完全與從蛋白質組數據獲得的3個階段重疊，僅有與基于轉錄組的分類的一個時間點（E17.5）差異。這些觀察結果表明，基于蛋白質或RNA表達水平，從E12.5到W8的發育過程可大致分為三個階段。半監督層次聚類分析基于其時間表達模式將基因分為四組（圖5b），第一階段差異表達的大多數基因富含幾種途徑，例如剪接體、RNA轉運和細胞周期（圖5c）；第二階段包含兩個參與粘著斑、ECM-受體相互作用，幾種信號傳導途徑和脂肪酸或氨基酸降解的基因組；第三階段主要與氧化磷酸化和代謝活動有關。總體而言，基于RNA-Seq的聚類分析揭示了三個階段，與蛋白質組數據獲得的生物學特征有相似性。
前人研究揭示了剪接異構體在各種生物過程中的作用，如器官發育，當通過FPKM≥1過濾時，作者發現7769個基因的24346種剪切異構體，其中2989種異構體在三個階段（基于RNA-Seq的聚類）差異表達，在這些通路調節因子或轉錄因子中，并非所有剪接異構體都發生顯著變化，其中一些變異體在mRNA水平上沒有或非常低表達（圖5d）。這些結果表明，只有一小部分剪接異構體在蛋白質水平上表達，并且在功能上與胃發育有關。
圖5 小鼠胃發育轉錄組學
5. 胃發育與胃癌的相關性
作者收集84名彌漫型胃癌患者白質組數據集，在蛋白質組水平上研究胃發育和胃癌的相關性。作者用蛋白質組學和轉錄組學方法分別鑒定到241和725個轉錄調節因子，發現在與器官發育和癌癥相關的充分表征的轉錄調節因子中。當細胞處于快速分裂和增殖時，它們中的大多數在早期胚胎階段（Ph1）中更高表達，例如CDX2是胃癌的預后標志物，其RNA在胃發育的早期階段升高。
在胃發育的八個關鍵信號通路中的蛋白質或基因中，有大量蛋白質或基因在胃發育三個階段中差異表達（圖6）。大部分這些基因在彌漫型胃癌（DGC）也是差異表達或突變基因。如Wnt信號通路中的WNT5A顯著上調，而Apc和Ctnnb1在DGC中突變。胃發育和DGC中這些調節因子的改變清楚地表明，轉錄調節因子和胃癌中的信號傳導途徑的失調。
為了進一步將胃發育與胃癌的信號通路水平相關聯，作者進行雙尾超幾何統計檢驗以確定在胃發育和DGC之間的特定途徑上是否存在改變的基因產物顯著重疊。發現除hedgehog信號通路外的所有途徑均表現出高度相關性（-log10P-value >3）（圖7a），表明胃發育和胃癌的發生可能是兩個相關的過程。為了獲得DGC中鑒定的上調蛋白在胃發育中表達的全局視圖，作者將939種腫瘤差異表達的蛋白質映射到小鼠胃發育期間的15個時間點中，發現 Ph1 鑒定出蛋白質的百分比明顯高于后期時間點（圖6b）。這說明胃癌與胚胎胃發育具有許多共同特征，并且該疾病可能由轉錄因子和細胞信號傳導的失調引起。
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圖 6 涉及胃發育和胃癌的關鍵信號通路
圖7? 胃發育與胃癌相關性分析
文章小結
作者描繪了小鼠胃發育過程蛋白質和 mRNA 水平全景圖，確定了胃發育過程中三個不同階段。將蛋白質組學和轉錄組學數據結合在一起，檢測和驗證可能對胃發育有根本影響的可變剪接轉錄本。通過比較胃發育的蛋白質組學特征與彌漫型胃癌的蛋白質組學特征，發現顯著數量的途徑調節因子，特別是在DGC中上調或經常突變的轉錄因子，在胃發育期間也差異表達，證明了胃癌和胃發育之間存在相關性。
解析文獻
Xianju Li, Chunchao Zhang, et al. A time-resolved multi-omic atlas of the developing mouse stomach[J]. Nature Communications, 2018, 9:4910.
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