題目：Characterization of three positive regulators of tetramycin biosynthesis in Streptomyces ahygroscopicus
期刊：FEMS Microbiology Letters
影響因子：1.765
影響因子：1.765
合作技術(shù)：EMSA
研究背景
放線菌在生長的過程中會(huì)產(chǎn)生較多的次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些次級(jí)代謝產(chǎn)物合成與細(xì)胞的分化有著密切的關(guān)系，同時(shí)這些代謝產(chǎn)物的調(diào)控也受到各方面因素的調(diào)控。
本文先對(duì)氨基酸序列、結(jié)構(gòu)域分析以及同源比對(duì)的方法鎖定LAL家族3個(gè)正調(diào)控子ttmRI、 ttmRII、ttmRIII 。再通過同源重組的方法缺失這三個(gè)基因，并觀察基因缺失后對(duì)放線菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物、菌體的生長形態(tài)的影響，最后結(jié)合RT-PCR民和EMSA結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個(gè)調(diào)控基因存在互相調(diào)控和自身調(diào)控現(xiàn)象，說明四霉素生物合成中存在復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)四霉素的生物合成進(jìn)行嚴(yán)格調(diào)控。本文對(duì)四霉素生物合成調(diào)控基因的功能分析，豐富了對(duì)抗生素生物合成調(diào)控的認(rèn)識(shí)。
研究內(nèi)容及結(jié)果
通過蛋白結(jié)構(gòu)域分析、氨基酸序列比對(duì)以及蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的模擬，初步判斷ttmRI、 ttmRII、ttmRIII 3個(gè)基因?qū)儆谡{(diào)控基因，且3個(gè)蛋白的N端均含有NTP結(jié)合區(qū)域的保守序列WalkerA（GPxGxGxx）和WalkerB（LxxVDD），Ｃ端含有螺旋－轉(zhuǎn)角－螺旋結(jié)構(gòu)（HTH結(jié)構(gòu)，DNA結(jié)合區(qū)域）的保守序列GlxnxxIAxxLxVSxrxVExHLTxxxyRKLxV，屬于LAL家族調(diào)控蛋白的特征結(jié)構(gòu)；另外，以上3個(gè)蛋白內(nèi)部均含有與蛋白相互作用相關(guān)的TPR結(jié)構(gòu)。
通過同源重組的方法分別敲除ttmRI、 ttmRII、ttmRIII三個(gè)基因，得到三個(gè)基因的缺失株。并通過PCR的方法檢測基因敲除成功。
敲除ttmRI、 ttmRII、ttmRIII后，發(fā)酵產(chǎn)物中四環(huán)素A、四環(huán)素B的的產(chǎn)量相對(duì)于出發(fā)菌株（H42）來說，會(huì)相應(yīng)的減少。ttmRI、ttmRIII基因只是影響次級(jí)代謝產(chǎn)物的形成，而并不會(huì)影響菌株的生長及菌體分化，ttmRII對(duì)菌落抱子色素合成有一定的影響。
對(duì)基因簇中的20個(gè)基因做QPCR檢測，結(jié)果顯示除ttmD 和 ttmL.兩個(gè)基因未下調(diào)外，其他基因在不同程度上均受到不同程度的抑制。說明LAL家族ttmRI、 ttmRII、ttmRIII調(diào)控子直接或者間接調(diào)控上述基因的轉(zhuǎn)錄。
為進(jìn)一步驗(yàn)證ttmRI、 ttmRII、ttmRIII調(diào)控子作用與上述基因的機(jī)制，對(duì)三個(gè)調(diào)控子的主要的結(jié)構(gòu)域截短后在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)純化。用表達(dá)純化的結(jié)構(gòu)域與上述基因的啟動(dòng)子在體外進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn)檢測，以驗(yàn)證ttmRI、 ttmRII、ttmRIII對(duì)基因的調(diào)控是直接作用還是間接作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：ttmRI對(duì)ttmKp, ttmGp, ttmS1p, ttmRIVp, ttmRIp， ttmJ-A有直接調(diào)控；ttmRII對(duì)ttmGp, ttmRIVp, ttmRIp有直接調(diào)控；ttmRIII對(duì)ttmEp, ttmGp, ttmS1p, ttmRIVp, ttmRIp， ttmJ-A有直接調(diào)控。
鏈霉菌中四霉素的生物合成被基因簇內(nèi)3個(gè)調(diào)控基因組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控，3個(gè)調(diào)控基因調(diào)控范圍既有重疊又有差異，同時(shí)還存在互相調(diào)控及自我調(diào)控的現(xiàn)象，從不同方向看各調(diào)控子在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中所處的等級(jí)不同。
從ttmR阻斷株中四霉素產(chǎn)量看，缺失ttmRI四環(huán)素產(chǎn)量最高，說明ttmRI對(duì)四霉素生物合成調(diào)控能為最弱。從調(diào)控基因的調(diào)控作用范圍來看，ttmRII基因除了通過調(diào)控功能基因轉(zhuǎn)錄來控制四環(huán)素合成之外還對(duì)還對(duì)菌落抱子色素合成有影響，而ttmRI、ttmRⅢ僅調(diào)控四霉素的生物合成。從調(diào)控子對(duì)各基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用來看，ttmRI、 ttmRII、ttmRIII成的轉(zhuǎn)錄單元的轉(zhuǎn)錄受其本身調(diào)控。
文章小結(jié)
1. 成功的構(gòu)建了ttmRI、 ttmRII、ttmRIII三株缺失株。
2. 四霉素生物合成基因簇中存在3個(gè)正調(diào)控基因ttmRI、 ttmRII、ttmRIII調(diào)控，三個(gè)基因均屬于LAL家族調(diào)控子，其中ttmRII還對(duì)抱子色素具有調(diào)控作用。
3. 在四霉素生物合成時(shí)，調(diào)控子ttmRI、 ttmRII、ttmRIII形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
4. 分別在出發(fā)菌株中增加3個(gè)調(diào)控基因拷貝數(shù)，增加ttmRI、 ttmRII、ttmRIII時(shí)，四霉素產(chǎn)量反而下降，且増加的拷貝數(shù)越多四霉素產(chǎn)量越低。這說明不吸水鏈霉菌中可能存在ttmRI、 ttmRII、ttmRIII的濃度界限，當(dāng)調(diào)控子濃度高于這個(gè)濃度會(huì)導(dǎo)致四霉素產(chǎn)量降低。
解析文獻(xiàn)
Hao Cui , Shoujia Liu , et al(2016). Characterization of three positive regulators for tetramycin biosynthesis in Streptomyces ahygroscopicus. FEMS Microbiology Letters. 61:123-154
Hao Cui , Shoujia Liu , et al(2016). Characterization of three positive regulators for tetramycin biosynthesis in Streptomyces ahygroscopicus. FEMS Microbiology Letters. 61:123-154
參考文獻(xiàn)
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