題目：Characterization of three positive regulators of tetramycin biosynthesis in Streptomyces ahygroscopicus
期刊：FEMS Microbiology Letters
影響因子：1.765
影響因子：1.765
合作技術：EMSA
研究背景
放線菌在生長的過程中會產生較多的次級代謝產物，這些次級代謝產物合成與細胞的分化有著密切的關系，同時這些代謝產物的調控也受到各方面因素的調控。
本文先對氨基酸序列、結構域分析以及同源比對的方法鎖定LAL家族3個正調控子ttmRI、 ttmRII、ttmRIII 。再通過同源重組的方法缺失這三個基因，并觀察基因缺失后對放線菌的次級代謝產物、菌體的生長形態的影響，最后結合RT-PCR民和EMSA結果發現，3個調控基因存在互相調控和自身調控現象，說明四霉素生物合成中存在復雜的調控網絡，對四霉素的生物合成進行嚴格調控。本文對四霉素生物合成調控基因的功能分析，豐富了對抗生素生物合成調控的認識。
研究內容及結果
通過蛋白結構域分析、氨基酸序列比對以及蛋白質二級結構的模擬，初步判斷ttmRI、 ttmRII、ttmRIII 3個基因屬于正調控基因，且3個蛋白的N端均含有NTP結合區域的保守序列WalkerA（GPxGxGxx）和WalkerB（LxxVDD），Ｃ端含有螺旋－轉角－螺旋結構（HTH結構，DNA結合區域）的保守序列GlxnxxIAxxLxVSxrxVExHLTxxxyRKLxV，屬于LAL家族調控蛋白的特征結構；另外，以上3個蛋白內部均含有與蛋白相互作用相關的TPR結構。
通過同源重組的方法分別敲除ttmRI、 ttmRII、ttmRIII三個基因，得到三個基因的缺失株。并通過PCR的方法檢測基因敲除成功。
敲除ttmRI、 ttmRII、ttmRIII后，發酵產物中四環素A、四環素B的的產量相對于出發菌株（H42）來說，會相應的減少。ttmRI、ttmRIII基因只是影響次級代謝產物的形成，而并不會影響菌株的生長及菌體分化，ttmRII對菌落抱子色素合成有一定的影響。
對基因簇中的20個基因做QPCR檢測，結果顯示除ttmD 和 ttmL.兩個基因未下調外，其他基因在不同程度上均受到不同程度的抑制。說明LAL家族ttmRI、 ttmRII、ttmRIII調控子直接或者間接調控上述基因的轉錄。
為進一步驗證ttmRI、 ttmRII、ttmRIII調控子作用與上述基因的機制，對三個調控子的主要的結構域截短后在大腸桿菌中進行表達純化。用表達純化的結構域與上述基因的啟動子在體外進行EMSA實驗檢測，以驗證ttmRI、 ttmRII、ttmRIII對基因的調控是直接作用還是間接作用。實驗結果顯示：ttmRI對ttmKp, ttmGp, ttmS1p, ttmRIVp, ttmRIp， ttmJ-A有直接調控；ttmRII對ttmGp, ttmRIVp, ttmRIp有直接調控；ttmRIII對ttmEp, ttmGp, ttmS1p, ttmRIVp, ttmRIp， ttmJ-A有直接調控。
鏈霉菌中四霉素的生物合成被基因簇內3個調控基因組成的復雜網絡所調控，3個調控基因調控范圍既有重疊又有差異，同時還存在互相調控及自我調控的現象，從不同方向看各調控子在調控網絡中所處的等級不同。
從ttmR阻斷株中四霉素產量看，缺失ttmRI四環素產量最高，說明ttmRI對四霉素生物合成調控能為最弱。從調控基因的調控作用范圍來看，ttmRII基因除了通過調控功能基因轉錄來控制四環素合成之外還對還對菌落抱子色素合成有影響，而ttmRI、ttmRⅢ僅調控四霉素的生物合成。從調控子對各基因轉錄的調控作用來看，ttmRI、 ttmRII、ttmRIII成的轉錄單元的轉錄受其本身調控。
文章小結
1. 成功的構建了ttmRI、 ttmRII、ttmRIII三株缺失株。
2. 四霉素生物合成基因簇中存在3個正調控基因ttmRI、 ttmRII、ttmRIII調控，三個基因均屬于LAL家族調控子，其中ttmRII還對抱子色素具有調控作用。
3. 在四霉素生物合成時，調控子ttmRI、 ttmRII、ttmRIII形成復雜的調控網絡。
4. 分別在出發菌株中增加3個調控基因拷貝數，增加ttmRI、 ttmRII、ttmRIII時，四霉素產量反而下降，且増加的拷貝數越多四霉素產量越低。這說明不吸水鏈霉菌中可能存在ttmRI、 ttmRII、ttmRIII的濃度界限，當調控子濃度高于這個濃度會導致四霉素產量降低。
解析文獻
Hao Cui , Shoujia Liu , et al(2016). Characterization of three positive regulators for tetramycin biosynthesis in Streptomyces ahygroscopicus. FEMS Microbiology Letters. 61:123-154
Hao Cui , Shoujia Liu , et al(2016). Characterization of three positive regulators for tetramycin biosynthesis in Streptomyces ahygroscopicus. FEMS Microbiology Letters. 61:123-154
參考文獻
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