轉錄因子是一類參與基因轉錄調控的重要調節因子。不同轉錄因子的DNA 結合結構域識別不同基因啟動子區特定的堿基序列，行使抑制或激活該基因轉錄的功能。將目的基因啟動子區域（通常取轉錄起始位點TSS 上游-2000bp）、或針對結合位點進行突變、或分段截斷序列，構建到報告基因載體luciferase 的上游，共轉染轉錄因子過表達質粒，通過熒光素酶活反映轉錄因子對啟動子活性的調控作用。

圖1.轉錄因子與啟動子調控示意圖

常用載體：pGL3-Basic 、pGL3-Promoter

圖2 .載體信息

翌圣雙熒光素酶報告基因檢測服務流程

實驗步驟

  01

目的細胞質粒瞬轉預實驗

當選擇在目的細胞（而非293 工具細胞）中進行驗證實驗時，首先要確認目的細胞的質粒瞬轉效率，以及摸索合適的瞬轉體系，質粒瞬轉效率>40%以上時表明預實驗通過。

02

目的細胞質粒瞬轉預實驗

a. 將狀態良好，處于對數生長期的空白細胞用0.25%胰酶消化，用完全培養基懸浮成
單細胞懸液，細胞計數后，接種于24 孔培養板中；
b. 培養過夜，觀察細胞生長狀態。在細胞覆蓋率70%左右時，進行轉染實驗；
c. 轉染2 h 前換液為新鮮的培養基；
d. 轉染取無菌的1.5 mL EP 管，按照轉染試劑使用說明進行轉染復合物配置
e. 轉染48 h 后收集細胞樣品。

03 報告基因檢測

§ 

細胞樣品收集

a. 轉染后從培養箱中取靶細胞，輕輕吸凈培養液，PBS 洗滌2 次；
b. 棄去PBS，每孔加入100μL 的1×PLB（5X Passive Lysis Buffer 用無菌水稀釋而得）；
c. 細胞裂解后，將樣品轉移入Ep 管中，-80 度冰箱保存。

§ 

根據報告基因檢測試劑盒說明書操作進行檢測

§ 

a. 將充分裂解后的裂解產物，10,000-15,000 rpm 離心3-5 min。離心后將上清液移入新的EP 管進行后續檢測。

b. Renilla Luciferase Assay 工作液的配置：按照樣品要求的量，將Renilla Luciferase Assay Reagent(100×)按照稀釋比例加入Renilla Luciferase Assay buffer，混勻后室溫放置。

c. 熒光素酶檢測：

按照儀器說明書要求將熒光檢測打開，設定參數，測定時間為10 s，測定間隔為2 s；將樣品按照20 μL 的體積加入測量管中（保持每次樣品的加樣量一致），另外加入20 μL Firefly Luciferase Assay Reagent 混勻2-3 次（不能漩渦混勻），充分混勻后測定RLU（Relative light unit），同時設置Cell Lysis buffer 為空白對照孔；將檢測后的樣品，加入20 μL 配制的Renilla Luciferase Assay 工作液混勻2-3 次，充分混勻后測定RLU，同時設置Renilla Luciferase Assay 工作液為空白對照孔。

04

數據處理與分析，計算相對熒光強度

05

提供原始實驗數據與完整實驗報告

常規檢測分組

（1）過表達對照+啟動子對照+海腎內參(TK)

（2）過表達對照+啟動子野生型+海腎內參(TK)

（3）過表達對照+啟動子突變型+海腎內參(TK)

（4）轉錄因子過表達+啟動子對照+海腎內參(TK)

（5）轉錄因子過表達+啟動子野生型+海腎內參(TK)

（6）轉錄因子過表達+啟動子突變型+海腎內參(TK)

實驗預期結果

  01

轉錄因子促進靶基因啟動子區轉錄活性

02

轉錄因子抑制靶基因啟動子區轉錄活性

翌圣可提供雙熒光素酶報告基因檢測服務，加快基礎研究及藥物篩選進度

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