在生物制藥領域，抗體藥物的生產過程中，抗體聚體的形成一直是困擾研發人員的難題。聚體不僅會降低藥物的療效，還可能引發免疫反應，嚴重影響藥物的安全性和有效性。

今天，博格隆給大家分享一篇關于不同層析填料去除抗體聚體能力的研究，希望能為大家提供一些有益的參考。

研究背景

抗體聚體的形成通常與抗體分子的疏水區域暴露、二硫鍵異構化和分子間結構域交換有關。這些聚體在細胞培養收獲物中含量較高，不僅降低抗體藥物的生物活性，還可能引發免疫反應。鑒于這些聚體難以通過傳統的純化方法完全去除，因此開發高效的聚體去除方法，對于提高抗體藥物的質量至關重要。

實驗過程與實驗方法

實驗過程

在這項研究中，研究人員選取了八種不同類型的層析填料，包括疏水相互作用（HIC）層析填料、羥基磷灰石（HA）層析填料和混合模式層析填料，對一種在CHO細胞中表達的單克隆抗體（mAb）進行聚體去除測試。

實驗中，首先使用Protein A和陰離子交換（AEX）層析法對抗體進行初步純化，得到含有約14%聚體的中間產物。隨后，分別在不同的層析條件下，對這些層析填料的聚體去除能力進行評估。

實驗方法

● 層析柱：所有填料都裝在直徑為0.66cm、床高為15cm的柱子中。使用不同的緩沖液配方進行層析實驗。

● 分析方法：SEC-HPLC，所有樣品使用Tosoh TSKgel G3000SWXL不銹鋼柱進行分析，上樣量100μg樣品，流速為1.0mL/min，流動相為50mM磷酸鈉和300mM氯化鈉，pH6.8。

實驗結果

疏水相互作用層析（HIC）

在上樣樣品中添加高濃度鹽，使聚體結合，而單體流穿（FT）。聚體水平在FT中降低至1%以下，表明HIC層析在去除聚體方面具有很高的效率。

對于疏水層析，即便配基相同，不同材質的疏水填料也可能具有不同的疏水表現，樣品結合的鹽濃度需求也可能不同。因此，需要針對不同的樣品選擇合適的結合和洗脫條件以期達到理想的聚體分離效果。

羥基磷灰石（HA）層析

對該實驗中的mAb進行羥基磷灰石填料結合-洗脫模式純化，結果顯示使用鈉鹽梯度洗脫，比磷酸鹽梯度洗脫效果更好。

在洗脫緩沖液中添加PEG，可以顯著提高分離效果。這表明PEG的添加可以增強聚體的柱上保留，從而實現更好的分離。

混合模式層析

使用高分辨率的陽離子混合模式層析填料在pH5.5下進行結合洗脫模式純化，使用鹽梯度線性洗脫，可以實現高純度的單體洗脫，但洗脫峰有拖尾現象。使用精氨酸梯度洗脫可以改善分離效果。這表明精氨酸可以有效破壞聚體與層析填料的相互作用，從而提高分離效果。

采用同種配基，粒徑較大的陽離子混合模式層析填料在相同條件下，分離效果不如前一種，但添加PEG可以提高分離效果。這表明PEG的添加可以增強聚體的保留，從而實現更好的分離。

采用強陰離子混合模式層析填料在pH7.0下運行，使用線性精氨酸梯度洗脫，可以實現高純度的單體洗脫，但洗脫峰尾部純度較低。添加PEG可以提高洗脫液純度，但會增加洗脫體積。最終，使用步階精氨酸洗脫和調整合適的PEG梯度可以實現單體高純度和小洗脫體積。

陽離子交換層析（CEX）

在典型線性鹽梯度層析條件下，CEX層析無法有效分離單體和聚體。但在洗脫緩沖液中添加PEG，可以顯著提高分離效果，使單體和聚體完全分離，且通過進一步開發分步洗脫方法保持產品質量和收率。這表明PEG的添加可以顯著提高CEX層析的分離效果。

主要結論

多種層析填料的有效性

HIC和HA填料在去除聚體方面表現出強大的能力?；旌夏Ｊ綄游鎏盍弦诧@示出良好的聚體去除效果。

PEG和精氨酸的顯著作用

在純化過程中添加PEG和/或精氨酸可以顯著提高分離效果，尤其是在CEX層析中，PEG的添加可使單體和聚體完全分離。

操作參數的優化

對于每種填料，需要通過實驗確定最佳的操作參數，以實現最大的聚體清除和單體回收率。在大規模生產中，步階洗脫比線性梯度洗脫更有利于減少處理時間和洗脫體積。

相關產品信息

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參考文獻

[1] Zhang X, Chen T, Li Y. A parallel demonstration of different resins' antibody aggregate removing capability by a case study. Protein Expression and Purification. 2019;153:59-69. DOI: 10.1016/j.pep.2018.08.011.

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