一、酵母單雜交
酵母單雜交技術(shù)是在酵母雙雜基礎(chǔ)上發(fā)展而來的一種研究核酸-蛋白相互作用的工具，被廣泛用于研究真核細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)調(diào)控，如鑒別DNA結(jié)合位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)潛在的結(jié)合蛋白基因、分析DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域信息等。
二、核蛋白酵母雙雜交
核蛋白酵母雙雜交技術(shù)最初由Fields等人在研究酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4性質(zhì)時(shí)建立，后續(xù)經(jīng)過不斷改進(jìn)已發(fā)展成為一種成熟的蛋白-蛋白互作研究工具，具有簡(jiǎn)便、靈敏、可反映蛋白在活細(xì)胞內(nèi)互作真實(shí)情況的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于互作蛋白的篩選、蛋白相互作用的鑒定/驗(yàn)證、蛋白互作機(jī)理的探究、蛋白連鎖圖譜繪制等工作。
三、核酵母單/雙雜交點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證流程簡(jiǎn)介及圖片分析
A為誘餌，B為獵物。
篩選涉及到的報(bào)告基因：
（1）HIS3。
（2）ADE2。
（3）MEL1。
誘餌質(zhì)粒PGBKT7攜帶trp基因, ， 獵物質(zhì)粒PGADT7攜帶Leu基因。
篩選涉及到的平板：DDO[SD/-Leu/-Trp]，DDO/X[SD/-Leu/-Trp/X-α-gal]，TDO /X [SD/-Leu/-Trp/HIS3/X-α-gal]，QDO /X[SD/-Leu/-Trp/HIS3/Ade2/X-α-gal]
1、誘餌自激活驗(yàn)證
分析：誘餌質(zhì)粒重組質(zhì)粒PGBKT7-A和獵物空載PGADT7共轉(zhuǎn)化Y2Hgold酵母菌株。（1）涂布DDO平板能夠生長(zhǎng)，說明誘餌PGBKT7-A+ PGADT7已成功轉(zhuǎn)入宿主菌中且對(duì)宿主菌無(wú)毒性；（2）涂布TDO平板，不能生長(zhǎng)，說明誘餌PGBKT7-A+ PGADT7無(wú)自激活現(xiàn)象，不能激活宿主菌報(bào)告基因his的表達(dá)；（3）涂布QDO平板沒長(zhǎng)，說明誘餌PGBKT7-A+ PGADT7無(wú)自激活現(xiàn)象，沒有激活報(bào)告基因ADE2。
2、共轉(zhuǎn)驗(yàn)證——陰陽(yáng)性對(duì)照
3、共轉(zhuǎn)驗(yàn)證——實(shí)驗(yàn)組
分析：誘餌重組質(zhì)粒PGBKT7-A和獵物重組PGADT7-B共轉(zhuǎn)化Y2Hgold酵母菌株。（1）涂布DDO平板能夠生長(zhǎng)，說明誘餌PGBKT7-A+ PGADT7-B已成功轉(zhuǎn)入宿主菌中且對(duì)宿主菌無(wú)毒性；（2）涂布TDO平板能生長(zhǎng)，說明誘餌PGBKT7-A+ PGADT7-B能夠互作，激活了宿主菌報(bào)告基因HIS3的表達(dá)；（3）涂布QDO平板能長(zhǎng)，說明誘餌PGBKT7-A+ PGADT7-B能夠互作，同時(shí)激活了報(bào)告基因HIS3和ADE2的表達(dá)。
4、雙雜點(diǎn)種圖
1自激活: Y2H[PGBKT7-A+ PGADT7]
2實(shí)驗(yàn)組: Y2H[PGBKT7-A+ PGADT7-B]
3陽(yáng)性對(duì)照: Y2H[pGBKT7-53+pGADT7-T]
4陰性對(duì)照: Y2H[pGBKT7-lam+pGADT7-T]
5、酵母單雜點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證示意圖
P為誘餌啟動(dòng)子，B為獵物。
單雜篩選報(bào)告和抗性基因：
AbAr/ AUR-C，AUR1基因的一個(gè)顯性突變版本，編碼肌醇磷酸化神經(jīng)酰胺syn- thase酶。AUR1-C在Y2HGold/ Y1HGold酵母株中表達(dá)，是由于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，使GAL4轉(zhuǎn)錄激活和DNA結(jié)合域接近。可以添加ABA進(jìn)行背景抑制。,
誘餌質(zhì)粒PABAI攜帶Ura基因，獵物質(zhì)粒PGADT7攜帶Leu基因。
篩選所用到的平板：SD/- Leu，SD/- Leu/+AbA
自激活結(jié)果分析：PGADT7空載轉(zhuǎn)化含誘餌啟動(dòng)子PAbAi-PY1Hgold酵母菌株。
（1）涂布SD/-Leu平板能夠生長(zhǎng)，說明誘餌PAbAi-P已成功轉(zhuǎn)入宿主菌中且對(duì)宿主菌無(wú)毒性；
（2）涂布SD/-Leu/AbA(100ng/ml)， SD/-Leu/AbA(200ng/ml) 平板能生長(zhǎng)，說明200ng/ml的AbA不能抑制報(bào)告基因AbAr/ AUR-C ；
（3）涂布SD/-Leu/AbA(500ng/ml) ，SD/-Leu/AbA(800ng/ml)，SD/-Leu/AbA(1000ng/ml)平板沒長(zhǎng)，說明能夠抑制報(bào)告基因AUR1-C的最低AbA濃度為500ng/ml，后續(xù)可用AbA(500ng/ml)進(jìn)行共轉(zhuǎn)驗(yàn)證。如果AbA最高抑制濃度1000ng/ml仍然能夠生長(zhǎng)，則只能考慮截短誘餌啟動(dòng)子。
6、共轉(zhuǎn)驗(yàn)證——陰陽(yáng)性對(duì)照
、
7、共轉(zhuǎn)驗(yàn)證——實(shí)驗(yàn)組
分析：誘餌啟動(dòng)子重組質(zhì)粒PAbAi-P轉(zhuǎn)化Y1Hgold酵母菌株涂布SD/-Ura平板，挑取單克隆菌制備成感受態(tài)，將獵物重組質(zhì)粒PGADT7-B轉(zhuǎn)化到Y1Hgold【 PAbAi-P 】中。（1）涂布SD/- Leu平板能夠生長(zhǎng)，說明獵物重組質(zhì)粒PGADT7-B已成功轉(zhuǎn)入宿主菌中且對(duì)宿主菌無(wú)毒性；（2）涂布SD/- Leu /+AbA (500ng/ml)平板能生長(zhǎng)，說明誘餌PAbAi-P + PGADT7-B能夠互作，激活了宿主菌報(bào)告基因AbAr/ AUR-C的表達(dá)。
8、單雜稀釋點(diǎn)種圖
四、酵母單/雙雜點(diǎn)對(duì)點(diǎn)技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
1. 轉(zhuǎn)化效率高，較少假陰性；
2. 設(shè)置嚴(yán)格的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，排除假陽(yáng)性和假陰性；
3. 酵母雙雜系統(tǒng)采用多個(gè)報(bào)告基因，且每個(gè)報(bào)告基因上游調(diào)控區(qū)各不相同，可大幅度減少假陽(yáng)性；
4. 報(bào)告基因整合到染色體上，使基因表達(dá)水平穩(wěn)定，消除了由于質(zhì)粒拷貝數(shù)變化引起基因表達(dá)水平波動(dòng)而造成的假陽(yáng)性；
5. 嚴(yán)格設(shè)置點(diǎn)種驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)菌體生長(zhǎng)狀態(tài)，進(jìn)一步驗(yàn)證是否互作及互作強(qiáng)弱；
6. 嚴(yán)格保存原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)便于溯源。
