精品推薦 | 雙管齊下,miRNA表達分析變得更加簡單
MicroRNAs（miRNAs）是一種大小約21-23個堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發夾結構的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后生成。miRNA主要與靶基因mRNA3‘端非編碼區域特異性結合，調控轉錄后靶基因mRNA的翻譯過程，從而阻斷mRNA翻譯和促進mRNA降解導致蛋白質表達降低。miRNA的作用涉及個體發育、組織分化、細胞增殖和細胞凋亡等多種心血管疾病的發生發展。
圖1.miRNA體內合成示意
成熟的miRNA的長度只有20nt左右，通常正向引物就會覆蓋其全長甚至會有多余部分，反向引物就無處安置了。目前市面上解決方案就是在反轉錄時設法增加反轉錄產物長度。常見的方法有加尾法和莖環法。
加尾法利用PolyA 聚合酶為成熟的miRNA加上Poly(A)尾，以帶有通用序列的Oligo-dT作為反轉錄引物，合成加長miRNA對應的cDNA第一鏈。莖環法以折疊為莖環結構的通用序列作為引物合成加長miRNA對應的cDNA第一鏈，后續擴增過程中，莖環結構在適宜的溫度下會被打開，和相關擴增引物結合。
圖2. 加尾法合成miRNA
圖3.莖環法合成miRNA
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? 產品推薦 ?
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? 翌圣miRNA加尾法反轉定量組合（11148ES&11171ES) ?
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11148ES-Hifair? miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit(加 A 法)
試劑盒采用加尾法來進行miRNA第一鏈cDNA的反轉錄，產品中的2×Hifair? miRNA RT buffer包含了miRNA加尾反應和反轉錄反應的所有原料和引物，并經過精心優化，可保證miRNA 3‘末端的Poly(A)修飾過程和反轉錄過程同時高效進行。
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? 11171ES-Hieff? miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix(加A法) ?
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專門為miRNA定量檢測而研發的新一代預混形式的熒光定量PCR檢測試劑，含有特殊的ROX Passive Reference Dye，適用于所有qPCR儀器，無需在不同的儀器上調整ROX的濃度，只需在配制反應體系時加入引物和模板即可進行擴增。DNA 聚合酶采用化學修飾的熱啟動聚合酶，配合特殊的Buffer體系，使反應特異性更好，靈敏度更高，并能在更廣的范圍內進行準確定量。
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? 可兼容全平臺qPCR儀器
圖.以293T細胞的Total RNA為模板，用Hifair? miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)進行反轉錄，獲得的cDNA稀釋10倍后，用Hieff? miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)分別檢測hsa-miR-let-7b-5p、hsa-miR-let-7c-5p、U6內參基因。
? 檢出率高，最高可達10 pg
圖. 以人工合成hsa-miR-let-7e-5p(a)和293T細胞Total RNA(b)為模板，分別稀釋成以下梯度：60拷貝到606拷貝（6個梯度）和10 pg-100 ng(5個梯度)，用Hifair?miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)進行反轉錄，獲得的cDNA用Hieff? miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)檢測hsa-miR-let-7e-5p基因表達情況。
? 高特異性，能區分同家族miRNA間單堿基差異
圖. 人類hsa-let-7家族擁有多條miRNA，彼此間相差的堿基很少，甚至只有單堿基的差異。每個Let-7亞型（hsa-miR-let-7a~Let-7i，has-miR-98）的人工合成miRNA使用 Hifair?miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)進行反轉錄合成cDNA，以不用的引物，用Hieff?miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)分別擴增這些miRNA，利用公式2-ΔCTx 100%計算匹配率。結果顯示，可有效區分密切相關的亞型家族成員。
? 擴增效率出色
圖. 以人293T細胞和鼠源肝臟Total RNA為模板，擴增miR-let-7b-5p、miR-let-7c-5p、miR-let-7e-5p、miR-let-7f-5p基因。結果顯示，與同類產品相比，Hifair?miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)配套 Hieff? miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)的反應體系，具有優異的表現。
? 穩定性優秀，在 37℃穩定7天或凍融50次或配置體系在25℃保留48 h，效果依舊穩定
圖. 以293T細胞Total RNA為模板用Hifair? miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES) 進行反轉錄，獲得的cDNA稀釋10倍，用Hieff? miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) 檢測hsa-miR-let-7b-5p、hsa-miR-let-7c-5p、hsa-miR-let-7e-5p的表達情況。△Ct<0.5。
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翌圣miRNA莖環法反轉定量組合（11139ES&11170ES)
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11139ES-Hifair? III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)
該試劑盒基于Hifair? III Reverse Transcriptase而開發。該酶cDNA合成速度快，且熱穩定性大幅度提高，可耐受高達60℃的反應溫度，適合具有復雜二級結構的RNA模板的反轉錄。同時，該酶增強了與模板的親和力，適合少量模板以及低拷貝基因的反轉錄。Hifair? III Reverse Transcriptase合成全長cDNA的能力也有了提升，可合成長達19.8 kb的cDNA。
11170ES-Hieff? miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix(莖環法)
本產品是使用SYBR Green I嵌合熒光法進行miRNA定量反應的專用預混液。由于miRNA序列短，且同一家族的miRNA序列往往高度相近，故在定量時對特異性要求極高。本品基于熱啟動的 DNA 聚合酶，配以優化的Buffer，能夠極大地減少非特異性擴增；同時，特殊的ROX Reference Dye，使得預混液適應于所有qPCR儀器，無需在不同的儀器上調整ROX濃度，只需在配制反應體系時加入引物和模板即可進行擴增。
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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
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