lncRNAs是一類長度大于200個堿基且不編碼蛋白的RNAs轉錄本。實驗表明， lncRNAs中的小開放閱讀框可以編碼多肽，即微蛋白。微蛋白在細胞穩態、代謝和發育、應激信號傳導和DNA修復等過程中發揮作用，也會影響腫瘤的發生、侵襲和轉移過程，但微蛋白的作用機制尚不清楚。
2021年7月中科院生物物理所楊福全研究員團隊、陳潤生院士團隊及北京三博腦科醫院張宏偉教授合作在Journal of Extracellular Vesicles（IF 21.224）雜志上發表題目為 《LncRNA-encoded microproteins: A new form of cargo in cell culture-derived and circulating extracellular vesicles》的研究成果，利用蛋白組學、免疫共沉淀-質譜法技術揭示膠質瘤細胞衍生的外泌體中的微蛋白轉移可能代表了細胞間通訊的新機制。中科新生命在本次研究中提供了外泌體表征服務。
【研究材料】
細胞和人血漿外泌體
【實驗分組】
蛋白組學、免疫共沉淀-質譜法(Co IP-MS)、RT-PCR和免疫共沉淀
實驗方法
步驟1：lncRNA編碼的微蛋白理論數據庫構建；
步驟2：細胞衍生外泌體的提取和微蛋白鑒定及驗證；
步驟3：蛋白質組學揭示外泌體中微蛋白的潛在功能；
步驟4：血漿外泌體中的微蛋白鑒定及驗證。
研究結果
1. lncRNA編碼的微蛋白理論數據庫構建
為在膠質瘤細胞及衍生的外泌體中鑒定更多的新的微蛋白，作者優化了基于質譜的微蛋白分析流程，并構建了人類理論微蛋白數據庫。最近報道的功能微蛋白都可以在該數據庫中找到，驗證了該數據庫的高質量和全面性。
圖1 lncRNA編碼的微蛋白的鑒定流程
2. 膠質瘤細胞及其衍生外泌體中的微蛋白鑒定
為鑒定膠質瘤細胞及衍生的外泌體中新的微蛋白，作者提取了膠質瘤細胞衍生的外泌體，通過透射電子顯微鏡（TEM）和標記蛋白（CD9，CD63，CD81和Alix）的WB實驗驗證外泌體的純度，利用納米顆粒跟蹤分析(NTA)測定顆粒濃度和粒徑分布。利用TMT標記蛋白組技術在膠質瘤細胞和衍生的外泌體中分別鑒定到了84個和29個微蛋白，其中9個微蛋白是共有的。鑒定的大多數微蛋白長度小于100個氨基酸，最短的20個氨基酸。鑒定出的微蛋白中，只有不到15%是從AUG密碼子啟始的，32%的微蛋白起始密碼子相近，而大多數微蛋白的起始密碼子未知。為確定微蛋白的進化保守性，作者對多個物種基因組進行同源比對，發現靈長類動物中微蛋白有一半以上也存在于嚙齒類動物中。
圖2 膠質瘤細胞及衍生的外泌體微蛋白
3. 細胞及衍生的外泌體微蛋白驗證
為驗證編碼微蛋白的lncRNAs在膠質瘤細胞中是否表達，作者從膠質瘤細胞中提取核糖體，用RT-PCR檢測單體和多聚體相關的lncRNAs，發現8個測試的lncRNA都與核糖體相關，其中7個與核糖體結合的lncRNA的含量明顯高于游離的，表明lncRNA處于活躍翻譯的狀態。
為研究微蛋白115127的小開放閱讀框（smORF）是否具有翻譯活性，作者構建了融合表達載體115127-GFP，發現115127-GFP融合蛋白大量表達，用WB實驗證實115127-GFP融合蛋白大小與預測的分子量一致，進一步利用質譜分析了GFP抗體富集的沉淀蛋白，確證了微蛋白115127的存在，這些結果表明微蛋白115127的smORF具有翻譯活性。為了進一步驗證微蛋白是否能被包裝到外泌體中，作者構建了115127-FLAG融合載體，從轉染的細胞中收集外泌體，利用免疫熒光染色和WB檢測到115127-FLAG融合蛋白大量表達，115127-FLAG大小與預測的分子量一致，這表明微蛋白115127可以被分選到外泌體中。為研究微蛋白115127的潛在功能，作者利用免疫共沉淀-質譜法(Co IP-MS)分析115127-GFP的相互作用蛋白，發現與氧化還原應激相關的蛋白PrDX1、PrDX2、PrDX4及MAPK1和XPO1等顯著上調，且這些蛋白質可以形成PPI網絡，由此推測微蛋白115127可能參與了氧化還原應激過程。
圖3 細胞及衍生的外泌體中微蛋白的驗證
4. 血漿外泌體中微蛋白的鑒定
為鑒定人血漿中的微蛋白，作者利用蛋白質組學分別鑒定了三名健康人和三名膠質瘤患者血漿外泌體的微蛋白、以及健康人的血漿和無外泌體的血漿微蛋白，發現健康人血漿外泌體中包含48種微蛋白，高于血漿和無外泌體血漿微蛋白數量，這可能與外泌體的保護作用有關。在膠質瘤患者的血漿EVS中發現64個微蛋白，大多數微蛋白的長度都在100個氨基酸左右。作者進一步使用合成肽對鑒定到的微蛋白進行了靶向蛋白組驗證，選擇的13個微蛋白中有12個成功匹配，說明微蛋白鑒定的準確性非常高。利用主成分分析發現健康人與膠質瘤患者明顯分開，表明血漿外泌體中的微蛋白含量存在明顯差異，是潛在的有價值的標志物。
圖4 血漿外泌體中的微蛋白
小結
本研究首次發現并證明了在細胞和血漿外泌體中存在豐富的微蛋白，通過免疫共沉淀-蛋白組學技術找到了外泌體微蛋白的互作功能蛋白，揭示其可能參與了膠質瘤細胞中的氧化還原應激過程。此外，本研究還發現健康人和膠質瘤患者的血漿外泌體微蛋白存在差異，可以作為潛在的診斷和預后標志物，為其臨床應用開發奠定了基礎。
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