凝膠遷移實驗（EMSA）
凝膠遷移或電泳遷移率實驗（EMSA）可以：（1）研究 DNA 結合蛋白和其相關的 DNA
結合序列相互作用；（2）可用于 DNA 定性和定量分析；（3）用于研究 RNA 結合蛋白和特
定的 RNA 序列的相互作用。
凝膠遷移或電泳遷移率實驗（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一種研究
DNA 結合蛋白和其相關的 DNA 結合序列相互作用的技術，可用于定性和定量分析。這一技
術最初用于研究 DNA 結合蛋白，目前已用于研究 RNA 結合蛋白和特定的 RNA 序列的相互作
用。通常將純化的蛋白和細胞粗提液和 32P 同位素標記的 DNA 或 RNA 探針一同保溫，在非
變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復合物和非結合的探針。DNA-復合物或 RNA-復合物比非結
合的探針移動得慢。同位素標記的探針依研究的結合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當檢
測如轉錄調控因子一類的 DNA 結合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細胞抽提液。
在檢測 RNA 結合蛋白時，依據目的 RNA 結合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也
可用核或胞質細胞抽提液。競爭實驗中采用含蛋白結合序列的 DNA 或 RNA 片段和寡核苷酸
片段（特異）， 和其它非相關的片段（非特異），來確定 DNA 或 RNA 結合蛋白的特異性。
在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據復合物的特點和強度來確定特異結合。
DNA 樣品
[γ-32P]ATP、T4 多聚核.苷.酸激酶、Nuclease-Free Water、T4 多聚核.苷.酸激酶緩沖液、醋
酸.銨、TE、無水乙醇、TBE buffer、重蒸水、甲叉雙.丙.烯.酰.胺、丙.烯.酰.胺、甘油、過硫.酸.銨、
TEMED（四甲基乙.二.胺）、EMSA Gel-Shift 結合緩沖液、溴酚藍等
水浴鍋、PCR 儀、離心機、電泳儀、電泳槽等
一、探針的標記
1. 如下設置探針標記的反應體系：
（1）待標記探針 (1.75 pmol/微升) ：2 微升。
（2）T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) ：1 微升。
（3）Nuclease-Free Water ：5 微升。
（4）[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) ：1 微升。
（5）T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升) ：1 微升。
（6）總體積：10 微升
（7）按照上述反應體系依次加入各種試劑，加入同位素后，Vortex 混勻，再加入 T4
Polynucleotide Kinase，混勻。
2. 使用水浴或 PCR 儀，37℃反應 10 分鐘。
3. 加入 1 微升探針標記終止液，混勻，終止探針標記反應。
4. 再加入 89 微升 TE，混勻。此時可以取少量探針用于檢測標記的效率。通常標記的效率在
30%以上，即總放射性的 30%以上標 記到了探針上。為實驗簡便起見，通常不必測定探針的
標記效率。
5. 標記好的探針最好立即使用，最長使用時間一般不宜超過 3 天。標記好的探針可以保存在- 20℃。
二、 探針的純化
通常為實驗簡便起見，可以不必純化標記好的探針。在有些時候，純化后的探針會改善 EMSA
的電泳結果。如需純化，可以按照如 下步驟操作
1. 對于 100 微升標記好的探針，加入 1/4 體積即 25 微升的 5 M 醋酸銨，再加入 2 體積即
200 微升的無水乙醇，混勻。
2. 在-70℃至-80℃沉淀 1 小時，或在-20℃沉淀過夜。
3. 在 4℃，12 000 g-16 000 g 離心 30 分鐘。小心去除上清，切不可觸及沉。
4. 在 4℃，12 000 g-16 000 g 離心 1 分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀，但不宜過分干
燥。
5. 加入 100 微升 TE，完全溶解沉淀。標記好的探針最好立即使用，最長使用時間一般不宜超
過 3 天。標記好的探針可以保存在 -20℃。
三、EMSA 膠的配制
1. 準備好倒膠的模具。可以使用常規的灌制蛋白電泳膠的模具，或其它適當的模具。最好選擇
可以灌制較薄膠的模具，以便于干膠等后續操作。為得到更好的結果，可以選擇可灌制較大
EMSA 膠的模具。
2. 按照如下配方配制 20 毫升 4％的聚.丙.烯.酰.胺凝膠(注意：使用 29:1 等不同比例的 Acr/Bis
對結果影響不大)。
（1）TBE buffer (10X)： 1 毫升。
重蒸水：16.2 毫升。
（2）39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)： 2 毫升。
（3）80% 甘油： 625 微升。
（4）10% 過.硫.酸.銨 (ammonium persulfate) ：150 微升。
（5）TEMED ：10 微升
3. 按照上述次序加入各個溶液，加入 TEMED 前先混勻，加入 TEMED 后立即混勻，并馬上加
入到制膠的模具中。避免產生氣泡， 并加上梳齒。如果發現非常容易形成氣泡，可以把一塊
制膠的玻璃板進行硅.烷化處理。
四、EMSA 結合反應
1. 如下設置 EMSA 結合反應
陰性對照反應：
（1）Nuclease-Free Water ：7 微升。
（2）EMSA/Gel-Shift 結合緩沖液(5X) ：2 微升。
（3）細胞核蛋白或純化的轉錄因子： 0 微升。
（4）標記好的探針 ：1 微升。
（5）總體積 ：10 微升。
樣品反應：
（1）Nuclease-Free Water ：5 微升。
（2）EMSA/Gel-Shift 結合緩沖液(5X) ：2 微升。
（3）細胞核蛋白或純化的轉錄因子 ：2 微升。
（4）標記好的探針： 1 微升。
（5）總體積： 10 微升。
探針冷競爭反應：
（1）Nuclease-Free Water ：4 微升。
（2）EMSA/Gel-Shift 結合緩沖液(5X) ：2 微升。
（3）細胞核蛋白或純化的轉錄因子： 2 微升。
（4）未標記的探針： 1 微升。
（5）標記好的探針： 1 微升。
（6）總體積 ：10 微升。
突變探針的冷競爭反應：
（1）Nuclease-Free Water ：4 微升。
（2）EMSA/Gel-Shift 結合緩沖液(5X) ：2 微升。
（3）細胞核蛋白或純化的轉錄因子 ：2 微升。
（4）未標記的突變探針： 1 微升。
（5）標記好的探針： 1 微升。
（6）體積 ：10 微升
Super-shift 反應：
（1）Nuclease-Free Water：4 微升。
（2）EMSA/Gel-Shift 結合緩沖液(5X) ：2 微升。
（3）細胞核蛋白或純化的轉錄因子：2 微升。
（4）目的蛋白特異抗體 ：1 微升。
（5）標記好的探針：1 微升。
（6）總體積 ：10 微升。
2. 按照上述順序依次加入各種試劑，在加入標記好的探針前先混勻，并且室溫(20-25℃)放置
10 分鐘，從而消除可能發生的探針和蛋白的非特異性結合，或者讓冷探針優先反應。然后加
入標記好的探針，混勻，室溫(20-25℃)放置 20 分鐘。
3. 加入 1 微升 EMSA/Gel-Shift 上樣緩沖液(無色，10X)，混勻后立即上樣。注意：有些時候
溴酚藍會影響蛋白和 DNA 的結合，建 議盡量使用無色的 EMSA/Gel-Shift 上樣緩沖液。如果
對于使用無色上樣緩沖液在上樣時感覺到無法上樣，可以在無色上樣緩沖液里面添加極少量的
藍色的上樣緩沖液，至能觀察到藍顏色即可。
五、 電泳分析
1. 用 0.5XTBE 作為電泳液。按照 10V/厘米的電壓預電泳 10 分鐘。預電泳的時候如果有空余
的上樣孔，可以加入少量稀釋好的 1X 的 EMSA 上樣緩沖液(藍色)，以觀察電壓是否正常進
行。
2. 把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內。在多余的某個上樣孔內加入 10 微升稀釋好的
1X 的 EMSA/Gel-Shift 上樣緩沖液 (藍色)，用于觀察電泳進行的情況。
3. 按照 10 V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過 30℃，如果溫度升高，需要適當降低電
壓。電泳至 EMSA/Gel-Shift 上樣緩 沖液中的藍色染料溴酚藍至膠的下緣 1/4 處，停止電
泳。
4. 剪一片大小和 EMSA 膠大小相近或略大的比較厚實的濾紙。小心取下夾有 EMSA 膠的膠
板，用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊 緣的電壓液。小心打開兩塊膠板中的上面一塊(注：
通常選擇先移走硅.烷化的那塊玻璃板)，把濾紙從 EMSA 膠的一側逐漸覆蓋住整個 EMSA 膠，
輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠微微浸濕后(大約不足 1 分鐘)，輕輕揭起濾紙，這時 EMSA 膠
會被濾紙一起揭起來。把濾紙側向下，放平，在 EMSA 膠的上面覆蓋一層保鮮膜，確保保鮮
膜和膠之間沒有氣泡。
5. 干膠儀器上干燥 EMSA 膠。然后用 X 光片壓片檢測，或用其它適當儀器設備檢測。
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百螢生物帶你了解凝膠遷移實驗（EMSA）
作者：西安百螢生物科技有限公司 2019-01-25T14:01 (訪問量:10344)
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