帕金森病(Parkinson's disease,PD) 是一種最常見的神經退行性疾病，以黑質致密部多巴胺能神經元的嚴重缺失為主要特征。已有研究表明活性氧的過度表達與帕金森病的發生發展密切相關。谷胱甘肽（glutathione, GSH）作為一種抗氧化劑在腦內去除活性氧在的毒性作用，已成為治療PD的一種主要方式。在PD患者腦內普遍存在谷胱甘肽水平的降低，因此闡明GSH含量降低的機制及恢復提高GSH的水平對于防治PD至關重要。 2020年2月18日，Nature Communications（IF: 14.919）雜志在線發表了一篇題為Pyridoxine induces glutathione synthesis via PKM2-mediated Nrf2 transactivation and confers neuroprotection的研究成果，該研究利用蛋白質組學技術揭示了星形膠質細胞多巴胺D2受體（Dopamine D2 receptor，Drd2）激活后促進GSH合成的具體分子機制，并發現小分子化合物吡哆醇（Pyridoxine）可促進星形膠質細胞谷胱甘肽的合成，發揮神經保護作用。中科新生命在本次研究中提供了Label free定量蛋白組學服務。 【研究材料】 腦組織、星形膠質細胞、Drd2hGFAPcKO敲除鼠、Drd2flox/flox鼠（DRD2敲除鼠的對照組）等 【技術方法】 Labelfree非標記定量蛋白質組學、Co-IP、qRT-PCR等 已知多巴胺激動劑可誘導GSH的合成，即意味著多巴胺受體調控GSH的合成，而GSH主要在星形膠質細胞中產生，作者早期的研究也已證實星形膠質細胞多巴胺D2受體（DRD2）抑制了PD腦內的炎癥反應，故推測星形膠質細胞多巴胺受體調控GSH合成，作者利用蛋白組學等一系列實驗證實了該觀點并探究了具體的分子機制。 1. 星形細胞DRD2通過Nrf2激活促進GSH合成 為驗證多巴胺受體是在星形膠質細胞還是神經元中誘導GSH的合成，作者使用多巴胺激動劑（卡**林）（不同濃度梯度和時間梯度）分別處理兩種細胞，結果表明，星形膠質細胞（非神經元）上的多巴胺受體的激活誘導了GSH的合成（圖1a-1b）。通過DRD2受體激動劑（如喹吡羅）及DRD2敲除鼠（Drd2hGFAPcKO小鼠）證實多巴胺受體DRD2（非DRD1）促進了GSH的合成（圖1c-1e）。流式、基因集富集分析、Nrf2敲除等實驗證實了DRD2的下游效應蛋白為轉錄因子Nrf2（圖1f-k）且DRD2的激活通過增強Nrf2與Gclc和Gclm基因啟動子的結合從而增加Gclc和Gclm(GSH合成的兩個關鍵酶)的表達(圖1l-n)。 圖1 星形細胞DRD2通過Nrf2激活促進GSH合成 2. DRD2誘導了PKM2的二聚體化，從而結合并激活Nrf2的功能 轉錄因子與基因啟動子的結合需要轉錄共激活因子的協助，作者采用Labelfree非標記定量蛋白組學的方法篩選到PKM2（M2型丙酮酸激酶）為Nrf2的轉錄共激活因子（圖2a-2b），進一步實驗證實DRD2的激活誘導了PKM2-Nrf2的相互作用（圖2c），且PKM2是以二聚體（非四聚體）的形式與Nrf2結合從而激活了Nrf2與Gclc、Gclm的結合進而促進GSH的合成（圖2d-2h)。 圖2 DRD2誘導PKM2的二聚體化，從而與Nrf2結合并激活Nrf2的功能 3. DRD2的激活促進了β-arrestin2與PKM2的結合并促進PKM2的二聚化 DRD2的激活會影響G蛋白信號通路和β-arrestin偏向性信號通路，為驗證DRD2激活誘導PKM二聚化的具體分子機制，作者利用Gαi蛋白抑制劑（圖3a）、β-arrestin2敲除（圖3b-3i）實驗證明DRD2的激活是通過β-arrestin2與PKM2結合從而促進了PKM2二聚化。 圖3 DRD2的激活促進β-arrestin2結合并二聚化PKM2 4. 吡哆醇通過PKM2-Nrf2途徑促進GSH的合成 GSH的減少為PD的主要誘因之一，為找到一種能促進GSH合成的小分子化合物，作者對863種天然產物進行了篩選，根據這些化合物的Tm值的偏差、是否可以二聚化PMK2、是否可以在星形膠質細胞中提高GSH水平以及對細胞的毒性這幾種因素，最終找到了化合物：吡哆醇（即維生素B6）(圖4a-4e)。并進一步實驗證明了其可以二聚化PMK2、可以增強Nrf2與Gclc/Gclm的結合能力、可以促進GSH合成（圖4f-4l），且PKM2敲除后，上述功能失效。 圖4 吡哆醇通過PKM2-Nrf2途徑促進GSH的合成 5. 吡哆醇以不依賴DRD2的方式減少PD小鼠模型中的多巴胺能神經元損失 實驗結果顯示吡哆醇可以在DRD2敲除鼠中二聚化PKM2以及增加Gclc/Gclm的表達、促進GSH的合同，而DRD2激動劑（喹吡羅）在DRD2敲除鼠中無法發揮其功能，故證實吡哆醇是通過DRD2非依賴的形式通過PKM2-Nrf2途徑促進GSH的合成(圖5a-5d)。作者隨即在DRD2敲除鼠中先注射吡哆醇或DRD2激動劑（喹吡羅）后加入MPTP(構建小鼠PD模型的試劑)的方法檢測多巴胺神經元的受損情況，進一步證實了吡哆醇發揮作用是不依賴于DRD2的且在MPTP前給予吡哆醇可以減輕多巴胺能神經元損失的嚴重程度（圖5e-5h）。 小結 中科新生命，成立于2004年，專注于質譜技術方法在科技服務、生物醫藥、精準醫療領域的應用開發。經過17年+的時間積累，現已建立起了Labelfree、TMT、PRM、4D-labelfree、4D-DIA、DIA磷酸化、4D-Labelfree磷酸化/泛素化/乙酰化、N-糖基化、外泌體蛋白組學等多種蛋白組學技術平臺以及代謝組學、轉錄組學平臺。此外，中科新生命有著專業的數據分析平臺以及售后服務團隊，為老師提供全面的技術支撐和服務。歡迎感興趣的老師前來咨詢。
主要結果
圖5 吡哆醇可減少PD小鼠模型中的多巴胺能神經元損失
該研究發現了星形膠質細胞多巴胺D2受體(DRD2)通過二聚化PKM2介導了Nrf2與Gclc/Gclm的結合從而調控了GSH合成。此外，小分子化合物吡哆醇可以以DRD2不依賴的形式通過PKM2-Nrf2途徑促進GSH的合成。進一步的實驗表明，補充吡哆醇可增加黑質多巴胺能神經元對MPTP誘導的神經毒性的抗性。作者推測二聚體PKM2可能是帕金森病治療的潛在靶點。
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項目文章Nat Commun(IF 14.919) | 定量蛋白組學助力發現帕金森病治療新靶點
作者：上海中科新生命生物科技有限公司 2021-12-27T19:46 (訪問量:3825)
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