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克隆技術，又稱為“生物放大技術”，目前應用最廣泛的技術為“分子克隆”，即通過重組技術將目的DNA片段按照人們的設計定向連接起來，在特定的受體細胞中與載體同時復制并得到表達，產生新的遺傳性狀的技術。

大部分的分子克隆方法，諸如傳統分子克隆、TA克隆、Gatway克隆、TOPO克隆、無縫克隆等都繞不開目的片段制備、載體制備、連接、轉化、篩選等等步驟。其中，設計引物、載體和片段，都需要使用相應的分子克隆工具進行操作和模擬，接下來小翌會以同源重組為例，具體解析一下分子克隆技術中應用到的那些工具，為您的實驗提供好方法。

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01

基因組序列查詢工具

進行分子克隆實驗之前，需要根據下游實驗目的，確認實驗中應用到的片段物種并查找序列。假設需要在自己的載體上加入人基因組DNA，可以使用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）在線查詢，選擇“Nucleotide”，輸入“human”，點擊查詢后，獲得5000多萬條基因序列，如圖1所示。

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點擊序列如智人KIR3DL2蛋白的mRNA序列（KIR3DL2基因），進入界面后會給出該基因的來源物種、詳細名稱、功能描述、文獻出處、核酸序列及氨基酸序列信息等信息。點擊右上角的“Send to”可以獲得該基因的完整序列（純文本格式）。

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02

目的片段和載體引物設計工具

獲得目的片段后，根據同源重組原理，需要在插入片段的上下游引入15-25 bp的同源臂，GC含量40-60%，以保證片段與載體充分接觸并進行重組。可以通過翌圣官網“支持中心”的“同源重組引物設計”點擊進入，或者直接點擊無縫克隆引物設計軟件網址（https://www.yeasen.com/hieff-clone/）進行設計引物。輸入需要的載體序列和目的片段序列，選擇合適的酶切位點（不建議選擇載體和片段中都含有的酶切位點），生成引物，如圖3、4所示。

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值得注意的是，多個目的片段插入的雙酶切位點，實際添加到第一個片段的5’端和最后一個片段的3’端，中間片段不含有設計的酶切位點。通過引物合成公司合成需要的引物序列。接著使用翌圣高保真PCR試劑盒（Cat#10164ES）PCR擴增目的片段與載體。

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03

載體設計模擬軟件

當設計完目的片段后，需要對載體和片段進行模擬連接，保證實驗的準確性?？梢允褂肧napgene軟件模擬。以pUC19為載體，KIR3DL2基因為插入片段，進行克隆連接模擬。選擇“Actions”—“Gibson Assembly”—“Insert Fragment”，輸入相應的插入片段和載體序列，如下圖5所示，即可生成連接后的載體。點擊新生成載體的“History”可以模擬載體與片段連接的具體步驟，如圖6所示。

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模擬步驟后，即可使用翌圣新品通用型多片段快速克隆試劑盒（Cat#10923ES）連接目的片段，該試劑盒滿足6 μL小體系、10 ng低濃度載體與片段的連接，菌落數多，克隆陽性率高，客戶反饋效果好，如圖7所示。

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?小體系低濃度載體高效率重組??

實驗信息：載體大?。?369 bp；目的片段大?。?589 bp。

實驗數據：

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除了上述基礎的分子克隆技術應用工具外，還有如紐約大學研究人員開發的gRNA在線設計軟件（https://cas13design.nygenome.org/），用于設計CRISPR-Cas13的gRNA引物等。分子克隆應用工具多種多樣，應用好工具，能為我們的實驗添磚加瓦。小翌在這里祝您實驗順利，一氣呵成！關注我們，小翌會在下一期繼續帶來分子克隆方面的知識，為您的實驗帶來新的思路與方向，期待下一次的見面~

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04

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