編者按

甾體生物堿及其糖基化形式（Steroidal alkaloids and their glycosylated forms，SGAs）是茄科植物中產生的一類特殊化代謝產物，對植物病原體和食草動物具有防御作用。

迄今為止，在番茄中已經檢測到近100種甾體生物堿，其中α-番茄堿是葉片、花蕾和綠色果實組織中的主要SGA。

食物中高濃度的α-番茄紅素在食用時會引起苦味和喉嚨灼熱感。同時在番茄中，由于GAME1(一種進行番茄紅素半乳糖基化的UDP-糖基轉移酶)的沉默，番茄紅素的水平增加，會導致毒性表型，如生長遲緩、莖栓化以及葉和果實形態畸變等。

因此在果實馴化和育種過程中，選擇苦味較低、口感較好、毒性較低、SGAs含量較低的番茄果實具有重要意義。

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2021年3月來自以色列魏茲曼科學研究所的研究人員在Nature Plants 發表了題為The GORKY glycoalkaloid transporter is indispensable for preventing tomato bitterness的研究論文。

在這項研究中，作者破譯了成熟番茄果實保持低α-番茄紅素水平保持不苦澀的分子機制。發現GORKY (俄語中“苦”的意思)是NPF轉運蛋白的一員，其對于防止成熟番茄果實中的高α-番茄紅素水平至關重要。在成熟過程中，GORKY負責將α-番茄堿和其他甾體生物堿從液泡轉移到胞質結構域。這有助于整個α-番茄紅素庫代謝轉化為非苦味形式，從而使水果更加可口。

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【技術方法】植物非靶代謝組學、靶向代謝組學、遺傳作圖等方法

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【主要結果】

一、NPF轉運蛋白映射到與水果苦味相關的基因組區域

首先，作者篩選到一個在成熟果實中具有強苦味的番茄野生近緣品系 (EA03058)，為了研究代謝物組成的變化和EA03058苦味的相關性，他們使用代謝組學分析方法描述了水果提取物在不同發育階段的代謝物，通過主成分分析PCA描述了EA03058和非苦味樣品之間的主要差異，發現在果實成熟發育的破色期 （breaker stage） 和紅熟期 （red stage） 有比較打的差異 (圖1b)。

作者提出SGAs組成的變化可能是導致水果味道變化的原因。EA03058品系紅熟期的果實中含有高水平的α-番茄堿，同時成熟果實中七葉皂苷A含量顯著降低，這與非苦味果實樣品之間存在著巨大差異 (圖1c)。

圖1. 番茄果實發育和成熟過程中SGA成分的“代謝轉變”

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為了定位高α-番茄紅素的苦味基因位點，研究人員將EA03058與野生種Solanum pimpinellifolium和Heinz1706 (作為參考基因組) 雜交， 產生了兩個番茄定位群體 (圖2a)。

為了進一步縮小該區域的基因數量，后使用SNP進行補充，并通過精細定位將苦味基因位點減少到56個候選基因(圖2b)。同時利用150個品系的重測序的比較分析發現了20個SNP和一個612bp的缺失，這些SNP沒有出現在Heinz1706和其他重新測序的材料中。612bp的缺失位于NPF轉運蛋白同源基因的最后一個外顯子。作者將這個基因命名為GORKY (圖2c)。

另外9個含有GORKY缺失的材料 (包括EA03058) 的SGA檢測結果顯示，與WT成熟果實相比，α-番茄堿、羥基番茄堿、乙酰氧番茄堿和其他SGA途徑中間體的水平顯著更高，而七葉皂苷A的水平顯著降低，表明GORKY可能參與了α-番茄紅素向七葉皂苷甲的轉化。后者在果實成熟后積累在紅色果實中。這與GORKY在成熟果實中的表達水平最高，在葉和花組織中的表達水平較低(圖2d)一致。

圖2. 通過繪制“苦味”特征來發現GORKY候選基因

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二、番茄中GORKY的功能特性

為了探究GORKY的功能特性，研究人員構建了GORKY功能缺失植株，再對SGA進行檢測分析(圖3b)，進一步證實了GORKY能夠降低紅色成熟果實中的苦味。

三個GORKY功能缺失系的紅色成熟果實提取物的SGA在很大程度上類似于含有GORKY基因缺失的原始“苦味”品系(圖3c-e)。在檢測的所有三個突變等位基因的成熟果實中，α-番茄堿和脫氫番茄堿以及其他SGA途徑中間體(例如乙酰氧番茄堿、羥基番茄堿和乙酰氧羥基番茄堿)的水平大量增加，而七葉皂苷A的水平顯著降低(圖3d、e)。

圖3. GORKY活性的改變導致α-番茄紅素在成熟果實中的過度積累

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為進一步探究GORKY的功能特性，作者又構建了GORKY高表達植物GORKY-Ox并分析了三個獨立轉化系中的SGAs水平，顯示與WT葉相比表達增加了>200倍(圖4a)。

有趣的是，通常在綠色組織中檢測不到的“成熟”SGA七葉皂苷A在GORKY-Ox葉片中積累(圖4b)。此外，GORKY-Ox系也會影響植物的生長和發育，因為它們也表現出矮化和器官形態上的一些改變(圖4c)。

另外，作者也研究了GORKY功能性拷貝的過表達是否會恢復前人描述的“苦味”野生番茄品種EA07290的SGA圖譜(圖4d)。與EA07290本身相比，紅色成熟果實的SGA檢測結果顯示出明顯更高水平的七葉皂苷A (圖4e)。在這些過表達系的果實中，α-番茄堿和脫氫番茄堿的水平顯著較低，這表明表達GORKY的功能性拷貝能夠緩解“苦”的紅色成熟果實化學表型(圖4f，g)。

圖4. GORKY過表達導致SGA途徑中間體的過度積累