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細胞轉染注意事項,你都get了嗎？(下)

作者：翌圣生物科技（上海）股份有限公司 2022-12-14T13:14 (訪問量:7235)

細胞轉染注意事項,你都get了嗎？(下)

細胞轉染實驗從開始設計到最終的效果檢測，可以由6個過程組成：核酸準備、試劑選擇、細胞鋪板、轉染操作、細胞培養、效果檢測。每一步都會影響最終的結果，均存在不同的注意事項。上個月小翌分享了前3個過程的注意事項：

細胞轉染注意事項，你都get了嗎？（上）

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本期分享后面3個過程的注意事項：


轉染操作

1.條件摸索與優化：


不同的細胞及轉染試劑要求轉染的條件是不同的，同一種系的細胞株，在各實驗室不同培養條件下，其生物學性狀也會發生不同程度的改變，導致其轉染特性也發生變化。在進行不同核酸或不同細胞系的轉染時，需要再次優化實驗條件。不同的培養體系、不同的核酸與試劑比例，最好是在第一次實驗前做一個預實驗。初學者通常都不會在乎加入的核酸量，甚至愿意多加點，但是要注意的是，核酸量過少固然轉染效率不高，但過多同樣會降低轉染效率。

2.無血清配置復合物：


通常在開始準備核酸和轉染試劑稀釋液時要使用無血清的培養基或試劑自帶的組分，因為血清會影響復合物的形成。血清中含有大量的蛋白質，在轉染過程中，帶負電的蛋白質可能干擾陽離子脂質體/陽離子聚合物對核酸的吸附，影響轉染效率?，F在市面上也有一些改進了的轉染試劑，可以在轉染時含有血清。所以根據具體的試劑，操作上會有差異。

3.孵育時間：


不同的轉染試劑在核酸-轉染試劑復合物形成中，需要時間不同，一般是5min-30min之間，要注意避免孵育時間過長。

4.抗生素影響：


在部分轉染試劑的使用中，要考慮抗生素的影響。這些抗生素一般對于真核細胞無毒，但陽離子脂質體試劑增加了細胞的通透性，使抗生素可以進入細胞，降低細胞的活性，導致轉染效率降低。

細胞培養

1.優良的培養試劑：


血清是一種包含生長因子及其它輔助因子的不確切成分的添加物，對不同細胞的生長作用有很大的差別。胎牛血清（FBS）經常用到，便宜一點的有馬或牛血清。血清質量的變化直接影響細胞生長，因此也會影響轉染效率。對于RNA轉染，如何消除血清中潛在的RNase污染也是值得關注的環節。

2.是否換液：


轉染時不加血清是防止血清的干擾作用，轉染后可適時加入，補充營養。加入過早會引起未轉染細胞的優勢生長，過晚會引起較多細胞死亡。可實時觀察1/5細胞變圓的時候加入血清。盡管有些轉染試劑號稱不需要換液，也能取得不錯的效果，但是為了使細胞培養的環境更好，建議在轉染后6小時左右換有血清的培養基可能會更好。

效果檢測

1.檢測方法的選擇：


對于轉染效果的驗證主要取決于實驗目的基因/蛋白的性質。主要是mRNA和蛋白水平的驗證。mRNA水平可以使用普通PCR 或者定量PCR，前者是定性，后者定量。但是最主要的還是蛋白水平的檢測，如果是膜蛋白，那么流式檢測最方便；如果是胞外分泌型，那么用上清液做ELISA或者Western都可以；如果是胞漿分泌型的那么就用Western或者流式都可以。

2.檢測時間的選擇：


一般在轉染24-72h，靶基因即在細胞內表達。根據不同的實驗目的，24-48h后即可進行靶基因表達的檢測實驗。轉染48~72h后可檢測蛋白表達，如用于重組蛋白、抗體生產等。

以siRNA為例，siRNA轉染后，在mRNA水平下降后，接下來才會有蛋白水平的下降，一般來說，轉染后48-72小時進行蛋白檢測通常會得到較好的結果。

3.穩轉篩選：


如若建立穩定的細胞系，則可對靶細胞進行篩選，根據不同基因載體中所含有的抗性標志選用相應的抗生素就行篩選，常用的真核表達基因載體的標志物有潮霉素和新霉素等。


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翌圣明星CP--轉染試劑與PCR產品又登《Cell》期刊
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