編者按：本欄目為靈賦拓普生物《科研無止境·我與實驗動物那些事兒》入選作品展示系列，分享來自各個科研單位、醫院高校、實驗動物中心等科研老師們的優秀作品?？蒲惺且粓鰺o止境的探索，歡迎各位老師投稿，分享自己在日?？蒲兄械母邢?，我們期待與更多的動物科研同行攜手并進，創造生命科學領域更美好的明天。
作者：袁晨晨 （揚州大學附屬醫院消化內科胰腺中心）
無知無畏，歪打正著
在新冠肆虐的2020年春季，我的導師南京大學的李維勤教授把肝臟表達脂蛋白脂酶（LPL）基因實驗性治療LPL基因缺陷引發嚴重高甘油三酯血癥的課題交給了我。由于種種原因，大半年過去了，一只LPL基因缺陷的小鼠都沒有繁殖出來，合作單位-五加和基因公司給我們提供的腺相關病毒（AAV）-LPL在我手中毫無用處。眼看著畢業日期一天天逼近，我陷入了焦慮、懷疑和自我否定的負面情緒中。雖然導師及時發現并開導我，但實驗不能啟動我怎樣才能畢業呢？
因為我們實驗室主要研究高甘油三酯引起的急性胰腺炎，除了LPL基因缺陷的小鼠會發生高甘油三酯血癥，我們還有一種GPIHBP1（GPI，糖基化磷脂酰肌醇錨定高密度脂蛋白結合蛋白1）基因敲除的小鼠，這種小鼠很容易繁殖。GPI是一種結合LPL的蛋白，分布在血管內皮上。如果沒有GPI，LPL就不能水解血漿甘油三酯，因此也會引發高甘油三酯血癥，但在離乳后才發生。夜不能寐中，我突發奇想，反正都是高甘油三酯，把AAV-LPL給GPI缺陷的小鼠靜脈注射后肝臟去表達，說不定也能降低甘油三酯呢。我叫醒了室友，告訴他我的想法。他即使在半睡半醒中，一句話就甩過來了，A基因缺陷用B基因來治，腦子進水了嗎？我接著查了幾篇基因治療的文章，的確都是A基因缺陷用A基因來治，B基因缺陷用B基因來治。我本來還想去找導師商量的，這樣一來我就只能捫在心里了。但是這個想法一旦形成就反復地折磨著我。正好那幾天有一批GPI敲除的小鼠要淘汰，我就拿了幾只，把AAV-LPL從尾靜脈中注射了進去。一個星期后，從小鼠的眶靜脈取血離心后一看，沒有打AAV-LPL小鼠的血漿依然像牛奶一樣，是乳白色的。而那幾只打了AAV-LPL小鼠的血漿居然清亮的像啤酒一樣，其中的甘油三酯竟然降低到了正常小鼠的水平。
我沉住氣又等了一周繼續取血檢查，仍然是同樣結果，于是我告訴了導師。他也同樣難以置信，說GPI的基因缺陷怎么能用LPL來矯正呢？于是我們和合作單位開了一個線上會議。北大醫學部的劉國慶教授是研究LPL的專家，看到結果后也同樣很震驚。討論后先讓我用一批GPI敲除的小鼠給以不同的AAV-LPL劑量，重復一次實驗。同時我們查閱文獻、咨詢其它專家，屆時再來分析這種結果的原因。
深入分析，探索原因
重復實驗的結果表明，AAV-LPL可以劑量依賴性地矯正GPI缺陷小鼠的嚴重高甘油三酯血癥。GPI基因缺陷的小鼠LPL的生成是正常的，但是不能被GPI結合轉運到毛細血管的內皮細胞血管面上，并錨定在那里水解血漿中的甘油三酯，因此GPI缺陷的小鼠和病人都發生高甘油三酯血癥。但是GPI缺陷和LPL缺陷小鼠有一個顯著不同是LPL缺陷小鼠出生就是高甘油三酯，且兩三天之后就死亡了；而GPI缺陷小鼠出生時沒有明顯高甘油三酯，直到離乳后才發生高甘油三酯。鑒于血漿甘油三酯都是LPL水解的，這就表明在離乳前即使沒有GPI，LPL也能水解血漿甘油三酯。這是為什么呢？LPL不是需要GPI轉運到血管內皮表面才能水解甘油三酯嗎？難道哺乳期小鼠的LPL就不需要GPI轉運嗎？這是一個很令人不解的問題。
在第二次線上會議我提出了這個問題。劉老師說他記得在瑞典做博士研究時，他的導師曾經應用原為雜交技術研究過不同物種LPL的時空表達，說小鼠和其它動物不一樣，肝臟會在哺乳期表達LPL，但成年后就不表達了，而肌肉和脂肪組織仍然表達。并說GPI小鼠哺乳期沒有高甘油三酯很可能與肝臟表達LPL有關，當成年后肝臟不表達LPL了，血漿甘油三酯就不能被水解而發生高甘油三酯血癥。
可是問題來了，即使肝臟表達LPL，沒有GPI的話LPL同樣不能轉運到血管內皮表面水解血漿甘油三酯。我的導師是普外科專家，對肝臟的結構很熟悉，他說肝臟中肝血竇的毛細血管內皮和其它組織毛細血管的緊密連接不一樣，是疏松連接；內皮下還有狄氏腔隙，這樣可以保證血漿中需要代謝的大分子很容易穿過毛細血管和肝細胞直接接觸。也就是說，如果肝細胞表達LPL，就有可能不需要轉運到毛細血管表面就能和血漿中攜帶甘油三酯的脂蛋白發生相互作用。
但是還有一個問題，就是即使肝細胞表達的LPL不需要轉運到毛細血管內皮就可以分解血漿甘油三酯，那么在沒有GPI情況下，LPL是怎樣錨定在肝細胞表面水解血漿甘油三酯的呢？
帶著這些問題，我先應用定量PCR檢測了新生、哺乳期、成年后GPI缺陷小鼠和大鼠的肝臟LPL表達，結果發現的確小鼠的肝臟在新生期、哺乳期LPL基因表達水平比成年期高50多倍，而新生和哺乳期的大鼠肝臟和成年期一樣幾乎不表達LPL，因此大鼠出生后就發生嚴重的高甘油三酯血癥，而且新生和哺乳期死亡率很高。然后我檢測了靜脈注射AAV-LPL在各個組織的分布，發現95%以上的外源性LPL都表達在肝臟。接著我們又做了外源性LPL在肝臟的免疫熒光，證實LPL分布在肝細胞的表面而不是血管內皮上。通過查閱文獻，發現肝細胞表面有與GPI結構相似的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG），而且豐度很高。這樣我們就做了HSPG和LPL的共定位，證實外源性LPL和肝臟HSPG共同定位在肝細胞表面。我們后來又在GPI缺陷小鼠上補充做了AAV-LPL在肌肉的表達，結果LPL不能到達血管內皮表面，而且對血漿甘油三酯沒有影響。
擴大成果，圓滿收官
顯然，體內沒有GPI時，肝細胞表面的HSPG能夠替代GPI錨定LPL，而血漿可以通過肝血竇毛細血管的疏松連接，因此血漿甘油三酯能夠被肝細胞表面的LPL水解；肌肉和脂肪細胞雖然能產生LPL，并被HSPG錨定在肌肉和脂肪的細胞表面，但不能轉運到毛細血管內皮的血管面。而血漿不能通過肌肉和脂肪組織的毛細血管壁，因此血漿中的甘油三酯無法在肌肉和脂肪組織中被水解。這樣我歪打正著得到的肝臟表達A基因能矯正B基因缺陷所致高甘油三酯血癥的結果，就得到了合理的解釋。
回答了科學問題后，我們還將AAV-LPL的肝臟異位表達方法應用于GPI缺陷的成年和新生期大鼠，不僅糾正了大鼠的嚴重高甘油三酯血癥，還減低了新生大鼠的死亡率。我們進一步在接受AAV-LPL和沒有接受的GPI缺陷小鼠體內通過給以雨蛙素誘發急性胰腺炎，證明肝臟異位表達LPL能夠防止急性胰腺炎的發生，有可能作為一種新的治療方法應用于GPI基因突變導致嚴重高甘油三酯血癥發生急性胰腺炎的患者。
在導師的指導下，我們總結了這些數據，寫成了一篇“AAV-mediated hepatic LPL expression ameliorates severe hypertriglyceridemia and acute pancreatitis in Gpihbp1 deficient mice and rats”論文（AAV介導的肝臟LPL表達治療GPIHBP1缺陷小鼠和大鼠的嚴重高甘油三酯血癥和急性胰腺炎），投寄到了基因治療領域的權威期刊Molecular Therapy。兩周后我們收到了主編的回復，讓我們補充一些關于毒性研究和基因產物代謝數據，并修改一下英語的表達方式，并回答幾個有關AAV載體構建的問題。完成了這些工作再投回去，編輯部很快就通知我們文章接受了，于2023年11月在線發表（https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2023.11.018.）。當然我也順利地通過答辯畢業了。不過我心里總覺得有些對不起GPI缺陷的小鼠，是我當時的無知，讓它們獻身到了LPL肝臟異位表達的基因治療實驗中。