腫瘤的發生發展高度依賴腫瘤微環境（TME），其中腫瘤相關巨噬細胞（TAM）是最核心的基質細胞群。巨噬細胞在微環境刺激下可極化為功能相反的兩類：M1 型具有抗腫瘤作用，而M2型（即典型TAM）則通過促進血管生成、免疫抑制、腫瘤細胞增殖與轉移等發揮促癌作用。明確腫瘤微環境中M1/M2巨噬細胞的極化格局，是指導腫瘤免疫治療與預后判斷的關鍵。而流式細胞術正是檢測巨噬細胞極化、解析 TAM 功能的核心實驗手段，也是開展腫瘤免疫機制研究與臨床轉化的重要基礎。
不同巨噬細胞的抗原表達
圖片來源：Zhu, Liya, et al. "Tumor-associated macrophages as a potential therapeutic target in thyroid cancers." Cancer Immunology, Immunotherapy 72.12 (2023): 3895-3917.
材料與試劑
腫瘤單細胞懸液的制備
01 前期準備
分組標記：按實驗分組準備六孔板，標記荷瘤小鼠信息，每孔加 3ml DMEM 高糖培養基，冰上待用。
消化液配制：將 100× 消化液母液（100mg/ml 膠原酶 I + 20mg/ml DNase I），用 5% FBS-DMEM 高糖培養基稀釋 100 倍（終濃度 1mg/ml 膠原酶 I + 200μg/ml DNase I），37℃水浴預熱。
器械準備：剪刀、鑷子經雙蒸水清洗、75% 乙醇消毒后烘干備用。
02 腫瘤組織分離
頸椎脫臼處死荷瘤小鼠，75% 乙醇消毒；在腫瘤右側 1cm 處剪 2cm 切口，翻折皮膚暴露皮下腫瘤，沿邊緣剪開剝離（避開潰爛部位），放入預準備的六孔板中。
03 腫瘤組織剪碎
吸去六孔板中多余 DMEM，留 0.1ml 防止干燥；冰上用剪刀小幅度高頻剪碎腫瘤，至泥漿狀（肉眼無清晰組織塊）。
04 腫瘤組織消化
每孔加 2ml 預熱的 1× 消化液，用 1ml 槍頭打散組織碎末；37℃恒溫培養箱消化 30min，每 10min 晃動混勻 1 次（嚴格控時，可按腫瘤大小調整消化液用量）。
05 單細胞懸液制備
消化后冰上終止：每孔加 4ml 5% FBS-DMEM；將懸液經 70μm 細胞濾網過濾，用注射器后部輕輕研磨濾網上殘留組織（輕緩操作），用 DMEM 沖洗濾網；所得懸液 4℃、850×g 離心 5min。
腫瘤單細胞懸液的制備流程（Created in BioRender）
流式染色方案：多色panel設計與阻斷策略
01 Fc 受體封閉（阻斷非特異性結合）
離心棄上清，用 FACS 緩沖液重懸細胞，計數后調整細胞密度至2×10?個 /mL。
取100 μL細胞懸液加入 U 型底 96 孔板，按100:3比例加入抗 Fc 受體抗體（100μL 加 3 μL），4℃孵育 30 min。
02 流式抗體染色
用 FACS 緩沖液按抗體配色表配制流式抗體混合液（含 F4/80、MHCII、CD86、CD206 等靶標抗體）。
每孔加入70 μL抗體混合液，避光孵育（常規 4℃ 30 min，可按抗體說明書調整）。
03 對照設置（關鍵質控）
空白對照：不加對應靶標抗體（僅 FACS 緩沖液），用于區分自發熒光與特異性染色。
熒光扣除對照（FMO）：用于精準設定補償與陰性門。
04 洗滌、上機檢測
染色結束后，每孔加 200 μL FACS 緩沖液，4℃、850×g 離心 5 min，棄上清；重復洗滌 1 次，棄上清后加 300 μL FACS 緩沖液重懸細胞，轉移至帶濾網的流式管中（同步過濾細胞懸液）；用流式細胞儀檢測，FlowJo 10.0 軟件分析數據。
圈門策略：逐層細化，精準定位巨噬細胞
通過邏輯設門逐步篩選目標細胞群
01 基于 FSC-A（前向散射面積）和 SSC-A（側向散射面積）圈出完整的腫瘤組織總細胞群，排除細胞碎片；
02 基于 FSC-A 和 FSC-H（前向散射高度）圈出單細胞群，去除粘連的雙細胞 / 多細胞團；
03 基于 Fixable Viability Stain 780（APC/Cy7 通道）和 SSC-A，圈出活細胞（Live）群，排除死細胞的非特異性染色干擾；
04 在活細胞群的基礎上，基于 CD45（BV785 通道）和 SSC-A，圈出 CD45 + 的總免疫細胞群；
05 在 CD45 + 免疫細胞群中，基于 Ly6G（BV711 通道）和 Ly6C（BV605 通道）排除 Ly6G + 中性粒細胞、Ly6C + 單核細胞等其他髓系細胞；再基于 CD11b（PE/Cy7 通道）和 F4/80（BV421 通道），圈出 CD11b+F4/80 + 雙陽性的腫瘤相關巨噬細胞（TAM）群；
06 在 CD11b+F4/80+ TAM 群的基礎上，分別基于不同極化標志物設門：基于 MHCII（PerCP/Cy5.5 通道），圈出 MHCII 高表達的M1 型巨噬細胞（占 TAM 的 43.6%）；
07 基于 CD86（FITC 通道），圈出 CD86 高表達的M1 型巨噬細胞（占 TAM 的 20.6%）；
08 基于 CD206（PE 通道），圈出 CD206 高表達的M2 型巨噬細胞（占 TAM 的 30.6%）。
腫瘤巨噬細胞的流式圈門邏輯
數據來源：金靜思, 楊超, and 鄧劉福. "腫瘤微環境內巨噬細胞極化的流式檢測方法." Bio-protocol (2019): e1010311-e1010311.
注意事項
1、剪碎、終止消化步驟均在冰上操作，保護細胞活性；
2、研磨時切勿用力，避免脂肪污染細胞懸液；
3、消化時間嚴格控制，不可過長，可按需調整消化液用量。
4、嚴禁使用補償過大的熒光通道，避免串色干擾
5、2 次離心洗滌徹底去游離抗體，重懸后過濾上機，防堵儀器
參考文獻
[1] Zhu, Liya, et al. "Tumor-associated macrophages as a potential therapeutic target in thyroid cancers." Cancer Immunology, Immunotherapy 72.12 (2023): 3895-3917.
[2] 金靜思, 楊超, and 鄧劉福. "腫瘤微環境內巨噬細胞極化的流式檢測方法." Bio-protocol (2019): e1010311-e1010311.
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