內(nèi)參抗體你選對了嗎?
各位小伙伴，您是否在蛋白免疫印記時，面對各種內(nèi)參抗體而不知所措呢，內(nèi)參蛋白是生物體內(nèi)管家基因編碼的，在多組織中穩(wěn)定表達(dá)，用于驗(yàn)證免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中是否正常進(jìn)行和一種半定量檢測蛋白表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)對照，那么如何正確的選擇內(nèi)參抗體呢！可以從以下幾點(diǎn)去參考。
一、樣本種屬來源
1. 哺乳動物組織或著細(xì)胞來源的樣本，一般選擇β-actin、α-tubulin、GAPDH、Lamin- B、Histone H3、Na+/K+-ATPase。
2. 植物來源樣本，一般選擇plant actin、Rubisco等。
3. 其他研究較稀少的樣本，通過查詢相關(guān)文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫，選擇合適的蛋白作為內(nèi)參推薦ICG網(wǎng)站:http://icg.big.ac.cn/index.php/Main_PageICG
二、目的蛋白分子量
保證目的蛋白分子量與內(nèi)參相差大于5KDa以上，防止檢測時干擾，例如，目的蛋白為40KDa，不宜選擇β-actin（42KDa）作內(nèi)參，可考慮GAPDH (36KDa) 或者β-tubulin(55KDa)作為內(nèi)參。
三、內(nèi)參蛋白表達(dá)部位
因此，提取蛋白的部位不同，選擇的內(nèi)參蛋白也不同。比如有時胞質(zhì)、胞核分開提取而不提取總蛋白時，就要選擇相應(yīng)部位表達(dá)的內(nèi)參蛋白。如 H3在細(xì)胞核中高效穩(wěn)定表達(dá)，理論上在細(xì)胞質(zhì)不表達(dá)，那么對于胞質(zhì)提取的蛋白，就不能選用H3作為內(nèi)參蛋白，而應(yīng)該選擇細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的β-actin 、GAPDH α-Tubulin等作為內(nèi)參蛋白。（內(nèi)參評價推薦軟件geNorm、NormFinder）
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亞細(xì)胞定位 |
內(nèi)參 |
分子量KDa |
注意事項(xiàng) |
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胞漿、全細(xì)胞 |
β-actin |
42 |
不適用于細(xì)胞核提取物，因?yàn)棣?actin是染色質(zhì)重塑復(fù)合物中的組分;可能不適合于研究對象之間年齡差異大的情況 |
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α-Tubulin |
55 |
可能不適合于研究對象之間年齡差異大的情況，微管蛋白的表達(dá)隨著抗菌和抗有絲分裂抗性藥物而改變，因此在加入抗癌和抗真菌藥物時 |
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β-Tubulin |
55 |
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GAPDH |
36 |
組織細(xì)胞缺氧會引起GAPDH表達(dá)上調(diào)，因此不適用于與氧有關(guān)的研究，糖尿病等因素會導(dǎo)致 GAPDH的表達(dá)量增高 |
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Vinculin |
117 |
大分子量蛋白可參考 |
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線粒體 |
COXIV 系列 |
15-17 |
該系列蛋白主要集中于15-17KDa,如果目標(biāo)蛋白分子量接近，可考慮其他內(nèi)參 |
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HSP60 |
60 |
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細(xì)胞核 |
VDAC1/2 |
31-37 |
該系列蛋白主要集中于31-37KDa |
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Lamin B1 |
66 |
不是適用于胚胎干細(xì)胞，凋亡實(shí)驗(yàn)中不適合做內(nèi)參 |
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PCNA |
36 |
非增值細(xì)胞不適用 |
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TBP |
33-43 |
TBP在人類中是37-43KDa,在小鼠和大鼠中是33-36KDa，不適合凋亡實(shí)驗(yàn) |
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YY1 |
65-70 |
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Histone H3 |
17 |
多數(shù)蛋白分子量在17KDa左右，如果目標(biāo)蛋白分子量接近，可考慮其他內(nèi)參 |
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全血、血清、血漿 |
Transferrin |
77 |
表達(dá)狀況受某些疾病狀態(tài)和治療的影響，比如視黃酸 |
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Albumin |
66 |
含量極高，注意降低WB實(shí)驗(yàn)上樣 |
標(biāo)簽抗體搭配使用效果更佳
在研究蛋白相關(guān)相互作用等實(shí)驗(yàn)中比如pull down, 通過分子生物學(xué)手段，表位標(biāo)簽可融合至目的蛋白的 N或C 末端，常用的表位標(biāo)簽有 His、HA、Myc和GST 等。這些表位標(biāo)簽通常不會影響目的蛋白的生物活性和細(xì)胞內(nèi)定位。表位標(biāo)簽的出現(xiàn)，為科學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)提供了方便。
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表位標(biāo)簽 |
標(biāo)簽序列 |
分子量 |
標(biāo)簽抗體 |
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HA 標(biāo)簽 |
YPYDVPDYA |
1.1 KD |
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Myc 標(biāo)簽 |
EQKLISEEDL |
1.2 KD |
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DYKDDDDK |
DYKDDDDK |
1 KD |
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GST Tag |
- |
26 KD |
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GFP Tag |
- |
26.9 KD |
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V5 標(biāo)簽 |
GKPIPNPLLGLDST |
1.4 KD |
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S-tag |
KETAAAKFERQHMDS |
1.8 KD |
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E-tag |
GAPVPYPDPLEPR |
1.4 KD |
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