近年來，隨著RNA研究的不斷深入，線性RNA分子在生物學研究和治療開發領域展現出廣泛的應用潛力，例如mRNA疫苗。然而，長鏈線性RNA較短的半衰期限制了其有效性。環狀RNA (circRNA)是一類單鏈閉合的環狀RNA分子，與線性mRNA相比，circRNA具有穩定性高、免疫原性低、表達持久等優勢，已經成為下一代RNA療法賽道的新秀。circRNA體外環化技術是研究的關鍵，目前，RNA的體外環化主要通過化學合成和酶促連接（分為T4連接酶法和核酶法）兩種方法實現。

在眾多技術路線中，基于T4連接酶法的技術路線備受關注。該技術路線主要涉及到T4 DNA Ligase 1、T4 RNA Ligase 1以及T4 RNA Ligase 2這幾種關鍵酶。值得注意的是，不同的T4連接酶在功能方面存在著顯著的差異，這種差異決定了它們各自適用于不同結構的RNA連接任務。其中，T4 RNA Ligase 2在對雙鏈RNA缺口進行連接時，展現出了極高的連接效率。

圖1. T4連接酶作用原理比較[1]

T4 RNA Ligase 2，是一種依賴于ATP的雙鏈RNA連接酶（double-strand RNA ligase, dsRNA Ligase），具有RNA鏈分子間和分子內連接活性，可連接雙鏈RNA中的切刻，也可用于連接雙鏈結構中RNA 3´羥基與DNA 5´磷酸基的切刻。與T4 RNA Ligase 1相比，該酶對雙鏈RNA切刻的連接活性要明顯高于對單鏈RNA的末端連接。

T4 RNA Ligase 2能夠通過三步反應將相鄰的3´羥基與5´磷酸多核苷酸連接起來，其機理如下：

①連接酶與ATP反應形成酶-AMP復合中間體；

② AMP脫離酶-AMP復合體，與RNA的5’-磷酸結合，形成5’端腺苷化的RNA；

③ 5’端腺苷化的RNA與3’-OH連接形成磷酸二酯鍵，釋放AMP。

圖2.T4連接酶結構與作用機理[2][3]

基于T4 RNA Ligase 2在RNA連接中的卓越性能，翌圣生物隆重推出T4 RNA Ligase 2 (Cat#14652)，為您的分子生物學研究提供更高效、更穩定的工具。

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翌圣T4 RNA Ligase 2(Cat#14652) 性能展示

 01

連接活性強

將Yeasen和進口Supplier N*的T4 RNA Ligase 2按照不同投入量加入體系中對dsRNA底物進行連接，結果顯示其能有效連接dsRNA底物，連接效果與進口Supplier N*相當。

圖3. T4 RNA Ligase 2連接效果驗證注：20 μL反應體系中包含終濃度為20 μM的dsRNA連接底物

02

無核酸外切酶、切口酶、RNase酶殘留

將100 U T4 RNA Ligase 2分別與核酸底物一起孵育，瓊脂糖凝膠電泳比較譜帶變化。結果顯示翌圣3個批次的T4 RNA Ligase 2均無核酸外切酶、切口酶、RNase殘留。

圖4. T4 RNA Ligase 2核酸外切酶、切口酶、RNase殘留檢測結果

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參考文獻:

[1]Obi P, Chen Y G. The design and synthesis of circular RNAs[J]. Methods, 2021, 196: 85-103.[2]Easey A. Synthetic Biology Methods to Optimise T4 RNA Ligase Activities[D]. University of East Anglia, 2018.[3] Viollet S, Fuchs R T, Munafo D B, et al. T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis[J]. BMC biotechnology, 2011, 11: 1-14.