編者按：今天，我們特別回顧一項于2020年3月1日發表在《CLINICAL CANCER RESEARCH》的經典研究——《Organoid Cultures as Preclinical Models of Non-Small Cell Lung Cancer》，該研究利用患者腫瘤組織和患者來源的異種移植模型（PDX）構建非小細胞肺癌（NSCLC）類器官，并鑒定NSCLC類器官與患者腫瘤的基因組學和生物學的一致性，證實類器官是藥物測試和生物標志物驗證的潛在平臺。
一、研究背景
非小細胞肺癌（NSCLC）是全球癌癥相關死亡的主要原因，5年總生存率僅15%[1]。在過去的幾十年中，人們在開發NSCLC的臨床前模型方面付出了巨大的努力，包括二維（2D）細胞系、基因工程小鼠模型（GEMM）和患者來源的異種移植物（PDX）。這些模型的應用加速了我們對NSCLC生物學和發病機制的理解。盡管細胞系仍廣泛用于臨床前研究，但它們通常不能反映其原始腫瘤的生物學特征或患者腫瘤對靶向治療的藥物敏感性[2]。此外，盡管GEMM和臨床相關的PDX可能更接近患者體內的藥物應答反應，但使用這些模型的研究需耗費大量時間和費用[3]。因此，今日介紹的這項研究的目標是開發源自NSCLC和PDX組織的新型臨床前模型，并且新模型需具有經濟、快速、準確反映疾病的生物學等優勢。
在過去幾年中，源自原發性患者腫瘤和各種癌癥（包括結腸癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌和乳腺癌）PDX的類器官模型，相繼被報道。這些腫瘤類器官已被廣泛應用于藥物篩選和生物標志物鑒定等領域[4-7]。并且，在患者來源的類器官（PDO）上的藥物篩選結果與對應患者體內的應答情況高度一致[8]。此外，一些研究已經能夠培養來自小鼠和人類的正常肺類器官[9]，這些類器官由多種類型的氣道細胞組成，以了解正常肺部的發育和功能。研究也顯示，科研人員已能夠成功構建NSCLC類器官[10-12]。然而，這些研究中的NSCLC類器官是短期培養的，但缺乏類器官腫瘤細胞純度的系統研究，并且沒有提供有關模型長期生長的具體細節[11,12]。因此，仍然需要開發適用于NSCLC藥物篩選和生物標志物鑒定的NSCLC類器官平臺。
今日分享的這項研究能夠分別利用肺癌的原發腫瘤組織和PDX組織，構建產生短期（1-3個月，1-9代）和長期（>3個月，>10代）培養的NSCLC類器官，成功率為88%（57/65）。本研究證明了在體外短期和長期建立的NSCLC類器官都具有其匹配腫瘤組織的組織學特征和致瘤性。全外顯子組測序（WES）和RNA測序顯示，長期NSCLC類器官盡管在體外環境中多次傳代生長，但仍保留了其親本腫瘤的基因突變、拷貝和基因表達。本研究證明了NSCLC類器官可用于藥物測試，表明其在疾病建模和治療測試中具有應用潛力。
二、研究結果
1. NSCLC患者腫瘤和PDX來源的類器官建立
圖1 NSCLC類器官的建立和短期培養類器官的表征
圖2 長期培養類器官的組織學和生長表征
本研究從2015年到2017年共處理了19例手術切除的肺腺癌（LUAD），15例肺鱗狀細胞癌（LUSC），16例LUAD PDX和26例LUSC PDX用于類器官的建立。其中88%（57/65）成功培養為類器官，72%（47/65）的模型表現可短期培養（第1-9代，1-3個月），15%（10/65）的模型實現了長期培養。為了確定PDO中的腫瘤純度，本研究通過H&E和IHC對類器官和原始患者腫瘤的肺標志物TTF-1和TP63進行了細胞學評估，結果顯示，PDO和PDX來源的類器官（XDO）模型均未被正常細胞大量污染，分別有75%~97%和50%~90%的細胞為腫瘤細胞。本研究無法通過組織學評估在短期類器官培養中檢測到成纖維細胞和免疫細胞的存在。
此外，本研究表明，類器官反映了其親本腫瘤的TTF-1和TP63染色模式，表明它們概括了親本腫瘤的組織學。并采用短期類器官模型評估了臨床批準的EGFR靶向治療NSCLC的療效，即在三個 EGFR 野生型和一個 EGFR 外顯子19缺失的類器官模型中評估了 EGFR 抑制劑厄洛替尼，證明了短期類器官含有足夠的細胞數用于藥物測試，并可用作生物標志物驗證的臨床前模型。
本研究表明，在長期培養的類器官中，沒有被正?；蚍侨祟惣毎秩?。PDO由超過85%的腫瘤細胞組成，大多數XDO含有超過65%的EpCAM+細胞，在所有長期類器官模型中均有<8%的H2K陽性細胞。此外，長期建立的NSCLC類器官也保留了其親本腫瘤的組織學特征。
2、NSCLC類器官保留了其親本腫瘤的基因突變和拷貝數功能
圖3 類器官和匹配的患者腫瘤/PDX 的突變、復制數和轉錄組
為了評估類器官與其來源組織的遺傳特征一致性，本研究通過WES比較了九種長期類器官培養物與其親本腫瘤之間的體細胞突變譜和復制數變異。研究表明，類器官與其匹配的患者腫瘤和/或 PDX 組織之間的突變譜高度一致，說明培養條件不會破壞腫瘤基因組的穩定性?？截悢底儺悾–NV）分析也表明在類器官培養過程中，親代腫瘤的 CNV 譜基本保留。
為了確定類器官中是否保留了原有腫瘤組織的基因表達譜，該研究對9個匹配的類器官及對應的組織和/或 PDX 腫瘤的基因表達進行了 RNA-seq 分析。研究人員將兩種分型（ LUAD 和 LUSC ）的原代肺癌組織而來的PDX進行人特異性微陣列芯片，獲得的數據作為對照。將類器官基因表達譜與上述對照基因表達譜對比，研究者確定患者腫瘤和類器官之間的總體基因表達相關性是0.59，而 PDX 和類器官是0.8。此外，六個 XDO 中的五個和三個 PDO 中的一個之間的基因表達與其衍生類器官的匹配腫瘤組織之間的相關性高于任何其他類器官模型。總的來說，分子數據表明，體外生長條件能夠使類器官腫瘤細胞在很大程度上維持其親本腫瘤的關鍵分子特性。
3、長期NSCLC類器官在藥物測試中的效用
圖4 長期培養的NSCLC類器官用于藥物測試
為了探索長期培養的NSCLC類器官在藥物測試中的效用，研究人員調查了五個具有良好特征的潛在敏感的生物標志物改變的長期培養類器官模型的基因組數據。在患者、PDX和編號為“PDXO426”的類器官中檢測到 KRAS G13C突變和擴增。
KRAS突變細胞系的臨床前研究表明，與 KRAS 野生型細胞系相比，含有這種突變的腫瘤細胞可能對MEK抑制劑更敏感。為了確定PDXO426類器官中的KRAS 突變和擴增是否增強了其對 MEK 抑制劑曲美替尼的敏感性，本研究將其與沒有KRA突變的其他三種類器官模型進行比較。結果顯示，KRAS突變體PDXO426對 MEK 抑制劑曲美替尼（IC50 = 0.05 mmol/L）比其他三種具有野生型細胞系的類器官更敏感。MEK抑制劑司美替尼也產生了類似的結果。為了證實 PDXO426中的KRAS改變特異性地增強了其對靶向治療的敏感性。研究者還檢測了這四種類器官模型對EGFR抑制劑阿法替尼的應答情況。正如預期的那樣，相對于HCC827細胞系（已知有EGFR突變，對EGFR抑制劑有應答），四種類器官模型中沒有一種對阿法替尼有應答。
為了確定由PDXO426類器官模型顯示的特異性MEK抑制劑敏感性是否反映其來源的 PDX腫瘤的生物學特性，本研究評估了PDXO426的來源PDX模型對曲美替尼的敏感性。PDXO426 PDX表現出曲美替尼敏感性，而KRAS野生型PDXO274 PDX則具有耐藥性?？偟膩碚f，這些結果支持類器官作為臨床相關的腫瘤患者的替代品進行藥物測試。
4、NSCLC類器官用于聯合療法測試
圖5 FGFR1和MEK抑制劑在LUSC類器官模型中的組合
本研究接下來探討了NSCLC類器官是否也可以用作發現新的生物標志物和聯合療法的工具。通過RT-qPCR和Western分析獲得的FGFR1 mRNA和蛋白質定量顯示，相對于 PDXO149（FGFR1野生型） ，PDXO274表現出超過10倍的FGFR1 mRNA表達和更高的磷酸化FGFR1和總FGFR1蛋白表達。
這些結果表明，在PDXO274類器官模型中，FGFR1相關通路激活，是一個FGFR1擴增的類器官模型，這意味著患者對 FGFR抑制劑的應答率可能會降低。FGFR抑制劑 BGJ398的體外藥物測試顯示 PDXO274對 FGFR 抑制劑基本不敏感。在研究MEK和PI3K抑制劑與FGFR抑制劑聯合治療FGFR異常癌癥的有效性的基礎上，本研究在 FGFR1擴增的類器官模型中測試了曲美替尼和 PI3K 抑制劑BKM120與BGJ398。在BGJ398和曲美替尼組合中觀察到強協同作用（組合指數 < 0.5） ，而在 BGJ398和BKM120組合中觀察到弱協同作用（組合指數 > 0.5）。
此外，盡管單藥 BGJ398抑制pFGFR和pAkt，并且單藥曲美替尼僅抑制pErk，但是通過兩種化合物的組合實現了所有三種磷酸蛋白的靶向抑制。曲美替尼和BGJ398組合的功效在PDXO274的親本PDX中進一步體內驗證，這進一步支持了早期的論點，即類器官模型可以保留其來源腫瘤組織的靶向治療敏感性。總的來說，可以使用類器官和PDX模型進行藥物研究，這將大大提高臨床應答率。
三、編者點評：
本研究建立了一個從患者腫瘤和患者來源的異種移植模型中構建NSCLC類器官的方案。重要的是，研究者發現這些類器官保留了其親本腫瘤的組織學和分子特征，并證明了它們在藥物測試中的實用性。該類器官平臺提供了NSCLC臨床前模型，可能有助于未來的藥物篩選生物標志物鑒定。
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參考資料：
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