研究背景
食管鱗狀細胞癌是我國高發的癌癥，占全球病例數的50%。目前食管癌早診困難，70%的食管癌患者在初診時已發展為局部晚期或轉移性；預后較差，治療后的5年生存率仍僅有20%~30%。食管癌的發生和演進是一個長期過程。異常的細胞克隆要經歷包括低級別上皮內瘤變(low-grade intraepithelial neoplasia, LGIN)和高級別上皮內瘤變(high-grade intraepithelial neoplasia, HGIN)的癌前病變階段，最終發展成侵襲性的食管癌。盡管食管鱗癌的癌前病變和侵襲性癌的組織病理學特征已很清楚，但推動癌變細胞向惡性表型演進的分子機制一直尚不明了。
一百多年前，Paget醫生即提出腫瘤發生和轉移的“種子土壤假說”，即上皮細胞的惡變和進一步的轉移都依賴其周圍的微環境“土壤”。與上皮細胞關系最緊密，數量最多的基質細胞是成纖維細胞，以往的研究已經證明，通過參與基質重塑和分泌多種細胞因子，成纖維細胞在腫瘤發生過程中發揮著重要作用。正常食管組織中，成纖維細胞和上皮細胞均能維持穩定狀態，而在ESCC發生的癌前階段，隨著上皮細胞的一系列改變，成纖維細胞逐漸脫離正常的靜息狀態，激活為能推動腫瘤發生的腫瘤相關成纖維細胞。
研究結果
為了尋找ESCC發生過程微環境改變的原因，我們對ESCC發生過程中多階段的食管上皮細胞進行了單細胞和空間轉錄組測序，描繪了食管鱗癌發生過程中上皮細胞、成纖維細胞、內皮細胞和免疫細胞的變化（圖1）。
接下來我們鑒定了八個與癌發生過程相關的上皮細胞表達Programs，包括quiescent progenitor (QP), cycling (CY), mucosal defense (MD), terminal differentiation (TD), hypoxia-related stress (HY), reactive oxygen species-related stress (RS), deoxidation (DO)和 antigen presenting (AP)（圖1，圖2）。我們發現其中的上皮細胞MD program（Mucosal defence program）會隨癌變下降，且其中的關鍵基因ANXA1水平也隨癌發生在上皮中顯著表達下調（圖2）。
之前實驗室的研究已經發現了成纖維細胞是食管癌微環境的重要組成部分（Zhang et al,2021）1，為了進一步尋找食管癌發生過程中上皮細胞與微環境之間的具體串擾關系，我們解析了食管癌發生過程中成纖維細胞的變化，發現存在三類正常成纖維細胞SLPI-Normal fibroblast，CCN2-Normal fibroblast, APOE-Normal fibroblast,和兩類癌癥相關成纖維細胞iCAFs和myCAFs并描繪了他們之間的演進關系（圖3）。
我們計算了上皮細胞多種Program的打分與成纖維細胞水平之間的關系，發現MD program水平與微環境中的成纖維顯著負相關。相應結果在空間轉錄組中也得到了驗證。
接下來，我們在蛋白水平驗證了MD program相關基因ANXA1會隨著食管癌的發生顯著下降，并且與微環境中成纖維細胞的激活轉化高度負相關，在食管癌發生類器官模型中我們也驗證了這一相關性。為了尋找這一現象背后的機制，我們構建了敲除和過表達ANXA1的上皮細胞，并進行了人原代正常食管成纖維細胞（NF）共培養和小鼠皮下共注射成瘤實驗，發現上皮細胞中的AXNA1確實能維持正常成纖維細胞的靜息與穩定，抑制癌細胞對其的馴化和激活，特別是抑制其向myCAF轉化，從而降低活化成纖維細胞與myCAF的促食管癌變作用。通過重組蛋白和條件培養基處理的方式，我們發現這種維持作用是以分泌型ANXA1的方式發揮的（圖4）。
之后，通過Co-IP、熒光共聚焦定位和受體Rescue實驗，我們證明分泌型的ANXA1結合成纖維細胞表面的甲酰肽受體2（FPR2）從而維持成纖維細胞穩定狀態并抑制成纖維細胞激活。TGF-β是促進正常成纖維細胞激活并轉化為CAF中最主要也最關鍵的信號因子，通過食管類器官上清檢測，我們發現食管癌變過程中會上皮細胞會分泌TGF-β，且其分泌量持續上升。我們猜想，ANXA1作為維持成纖維細胞靜息狀態的信號分子，是否與TGF-β的作用相拮抗？于是我們檢測了成纖維細胞中TGF-β的信號下游和ANXA1的信號下游，我們發現前者會激活成纖維細胞中的ERK/AKT/SMAD3的磷酸化，并依賴這一信號通路活化成纖維細胞；而后者作用于FPR2后，會抑制這一信號通路的磷酸化，維持成纖維細胞的穩定狀態。說明上皮細胞作為主導者，在癌變中既提供成纖維細胞活化的“動力”TGF-β，又減少了成纖維細胞“剎車”ANXA1的分泌，最終導致成纖維細胞的惡性轉變（圖5）。
之后為了在體外驗證這一結論，我們對4NQO誘導的自發小鼠ESCC模型給予Ac2-26這一ANXA1的功能肽藥物處理，發現與對照相比，ANXA1的功能肽能有效延緩小鼠食管鱗癌的發生。
最后，我們希望尋找上皮細胞中ANXA1缺失的原因，首先我們計算了癌變過程中ANXA1的基因組CNV和甲基化水平變化，發現并沒有發生顯著改變，提示我們可能是調控ANXA1表達的轉錄因子發生了改變，通過數據庫預測、RNAi、ChIP-qPCR、EMSA和雙熒光素酶報告實驗等手段，我們發現并證明了ESCC癌發生過程中上皮細胞轉錄因子KLF4的丟失是ANXA1下降的關鍵原因，最終會直接推動成纖維細胞的活化（圖6）。
至此，我們證明了上皮細胞KLF4-ANXA1的逐步喪失及這種異常的上皮細胞與微環境之間的串擾是推動ESCC發生過程中的關鍵進程，為ESCC的精準防治提供了新的思路和方向。
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主要第一作者
陳亞玫，博士畢業于中國醫學科學院腫瘤醫院，目前在印第安納大學韓冷課題組從事博士后研究工作。研究方向為致力于利用生物大數據研究癌癥等復雜疾病的致病機理，整合多維度組學研究癌癥的發生機制和藥物反應。
祝世昊，現為中國醫學科學院腫瘤醫院博士研究生，師從林東昕院士。研究方向為解析食管癌發生過程上皮與微環境的串擾與共進化過程，尋找其中關鍵調控因素與其推動腫瘤發生的作用機制。
1. Zhang, X., Peng, L., Luo, Y., Zhang, S., Pu, Y., Chen, Y., Guo, W., Yao, J., Shao, M., Fan, W., et al. (2021). Dissecting esophageal squamous-cell carcinoma ecosystem by single-cell transcriptomic analysis. Nat Commun 12, 5291. 10.1038/s41467-021-25539-x.