編者按

由于復雜的發病機制和高度可變的個體藥物易感性，使得藥物誘導性肝損傷(DILI)的臨床前鑒定成為了一項重大挑戰。因此急切需要建立一個能夠在體外預測DILI的有效模型。

今天，我們回顧了一項于2021年發表在《Gastroenterology》的經典研究——《High-Fidelity Drug-Induced Liver Injury Screen Using Human Pluripotent Stem Cell–Derived Organoids》，該研究利用人多能干細胞誘導的肝類器官進行高保真藥物性肝損傷篩查。

一、研究背景

由于在最初的篩選中發現的候選藥物失敗，制藥行業每年在藥物開發上損失數十億美元，近三分之一的藥物被撤出市場。此外，盡管有很好的療效，但候選藥物的失敗會導致患者治療機會減少。臨床前研究通常將藥物的體外評估作為主要的療效篩選標準，以確定合適的化合物，然后再進行體外和體內安全性研究，以評估其代謝和毒理學機制。這種低效率的方法可以解釋為在評估人類藥物性肝損傷(DILI)時缺乏生理學相關的臨床前模型，因此迫切需要開發一種體外篩選模型來評估大量不斷增長的藥物化合物文庫。

肝原代細胞是一種高度極化的代謝細胞類型，形成具有微絨毛通道的膽管結構，將外周循環與膽汁酸分泌途徑分開。DILI的最上游環節包括肝細胞對藥物或其反應性代謝物的解毒，并通過轉運體，如多藥耐藥相關蛋白(MRP)轉運體)排泄到膽管，這表明需要重建這些獨特的組織結構，作為體內肝細胞預測DILI病理的關鍵特性。

然而，目前使用分離的原代人肝細胞或肝細胞系的簡化培養模型與體內生理學之間的藥物毒性特征存在相當大的差異，導致藥物轉化失敗或停滯，例如，曲格列酮、奈法唑酮和托爾卡酮。因此，毒理學特性的測定主要依靠動物作為藥物開發的重要步驟；然而，由于人類和動物在生理上的顯著差異，對人類結果的保真度明顯不足。

本文的研究人員最近報道了一種從多能干細胞(PSCs)生成人類肝臟類器官(HLOs)的方法，該方法具有模擬炎癥疾病的潛力。然而，功能性膽小管樣結構，作為模擬膽汁排泄缺陷的重要組成部分，是否形成并可用于藥物毒理學分析仍是一個謎。此外，在最大限度地減少批次差異的同時，在轉化為臨床前研究之前，提高分析通量將是至關重要的。

在此，本文的研究人員使用穩定可擴增的誘導PSC（iPSC）和胚胎干細胞。本文的研究人員建立了一種基于實時成像的動態檢測方法，可以通過敲除膽汁酸轉運體基因來阻止改良HLOs中膽汁酸的攝取和排泄。該檢測平臺適用于大規模的化合物篩選和解釋238種具有多重讀數的藥物。此外，HLOs被證明可以模擬基因型特異性對波生坦誘導的多個iPSC的膽汁淤積的易感性。這種名為肝類器官毒性篩查(LoT)的強大檢測方法提供了HLOs中開發的功能讀數，將促進診斷、功能研究、藥物開發和個性化醫療。

二、主要研究成果

1、人誘導多能干細胞誘導肝類器官的生成與表征

本文的研究人員首先建立了一種利用hiPSC衍生的前腸球體獲得大量均勻類器官的新方法(圖1A)。簡單地說，前腸細胞在第7天消化成單個細胞。在這個階段，游離的前腸細胞可以冷凍保存在－80℃。將新鮮或解凍的細胞包埋于Matrigel中，然后在由FGF2表皮生長因子、血管內皮生長因子、GSK抑制劑(CHIR99021)和轉化生長因子-B抑制劑(A83-01)，與抗壞血酸(補充圖2A和B)組成的類器官形成培養基中培養4天。第二天，本文的研究人員將培養物暴露在維甲酸(RA)中4天，維甲酸促進了膽管和膽管周鞘的形成。

接下來，本文的研究人員切換到肝細胞成熟培養基。高效地生成具有腔內結構的類器官(圖1B)，在5個因子的培養基中誘導的HLOs數量遠大于常規因子的培養基中誘導的，僅用RA處理(圖1C和D)。本文的研究人員證實HLOs是在5個因子下由多個iPSC細胞系形成的((補充圖2C)。此外，本文的研究人員證明HLOs在含有5個因子的類器官形成培養基中培養，然后在RA培養96小時，具有最高的白蛋白分泌效率(圖1E)。

圖1 從可凍存的psc來源的前腸細胞生成HLOs

2、人肝類器官的基因表達和功能分析

采用定量聚合酶鏈反應(qPCR)分析了HLOs中與肝功能傾向相關的代表性基因的表達，以揭示其肝臟譜系。肝臟標志物基因如白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)、細胞色素P(CYP)450家族2亞家族C成員9 (CYP2C9)和CYP7A1在HLO中表達上調(圖1F)。多藥耐藥相關蛋白2(MRP2)、膽汁鹽輸出泵(BSEP)、多藥耐藥1(MDR1)、BCRP1、納米-?；撬崮懰峁厕D運多肽(NTCP)、有機陰離子轉運蛋白2 (OAT2)、濃縮核苷轉運蛋白1(CNT1)、MRP3等極性和轉運蛋白活性相關基因的表達也有所增加。此外，這還伴隨著與未分化狀態相關的基因(如NANOG和OCT4)的逐漸減少。NANOG、OCT4、ALB、CYP2C9、MRP3和TDO2在6種不同供體的HLOs中的基因表達具有可比性((補充圖3A)。

HLOs的白蛋白分泌能力如圖1G所示。HLO和原代肝細胞白蛋白分泌水平分別為488.2±517.5 ng/mL/d和630.49±292.5 ng/mL/d，差異無統計學意義。雖然HLOs和原代肝細胞的白蛋白分泌水平相當，但兩者的白蛋白基因表達不同，這可能是由于HLOs和原代肝細胞的細胞組成不同所致。

酶聯免疫吸附法也證實了HLO培養上清中存在補體因子等肝細胞特異性蛋白(圖1H)。

最后，在功能水平上，本文的研究人員展示了HLO分別經利福平和奧美拉唑處理后的主要CYP誘導反應(圖1I和圖J)。此外，本文的研究人員還檢測了HLO中CYP2C9的誘導性，經利福平處理后，HLO中CYP2C9的反應性與原代肝細胞相當(圖1K)。

3、人肝類器官單細胞RNA測序分析

為了與原代肝細胞的分化狀態進行比較，本文的研究人員利用單細胞RNA測序(scRNA-seq)技術對第20天HLOs中的HLO來源細胞(5177細胞)進行了測序，并與5個獨立供體來源的原代人肝來源細胞[7]進行了整合分析(圖2A和附圖4)。t -分布隨機近鄰嵌入分析表明，HLOs中存在由實質細胞(74.41 %)和非實質細胞(25.59 %)組成的不同種群(圖2B和圖C)，在原代肝細胞中表達肝星狀細胞、門靜脈內皮細胞和膽管細胞的特征性標志物，如本文的研究人員之前的方法所見。

接下來，本文的研究人員研究了與近中心的、匯管區、間充質和內皮相關的基因表達，并與人原代肝細胞(補充圖4A)進行了比較。其中，雖然HLO來源的細胞包括非實質細胞群，但肝細胞的亞群(稱為肝細胞樣1、2細胞)與原代肝細胞幾乎相同，其余半數細胞代表肝母細胞樣狀態。在間充質和內皮的基因集合中，HLOs中的基因表達與人原代肝細胞具有相似性。

為了進一步探討肝細胞的特性，本文的研究人員從HLO和人原代肝細胞樣本中分離出肝細胞群體，并進行t分布隨機鄰嵌入分析。本文的研究人員發現88.99%的肝細胞樣2細胞位于門靜脈周圍原代肝細胞群中，而27.91%的肝細胞樣1細胞位于中心周圍原代肝細胞群中(圖2D和E)。

3區(肝臟的小葉中心區域)在藥物代謝和解毒方面發揮作用。最近在人類scRNA-seq[7]中報道的4個帶狀近中心的標記物的表達水平與原代肝細胞相似，其中包括一個關鍵的藥物代謝酶CYP2C9(圖1F)。通路分析表明，在中樞周圍和門戶周圍的高富集的基因組分別與HLOs患者的脂質/藥物代謝、CYP450和膽固醇生物合成過程相關。在HLOs的這些通路基因表達水平與一些原發性肝臟相似(補充圖4B)?？偟膩碚f，本文的研究人員的HLO模型包含了不同的和區域性的肝細胞群，在一定程度上模擬了原發性成人原代肝細胞的特征。

圖2 HLOs與人原代肝細胞的scRNA-seq分析

4、人類肝臟類器官的微觀解剖特征

免疫組化分析顯示HLO上皮細胞白蛋白和IV型膠原染色(圖3A)。此外，ZO-1、MRP2、BSEP、F-actin和MDR3的免疫染色表明，這些蛋白在染色肝細胞核因子4a(HNF4a)染色陽性的情況下優先定位于腔內區域。CYP7A1在HLO中也呈陽性染色。

膽小管是肝內最小的分泌通道，膽小管管腔由相鄰肝細胞相對質膜的改良的頂端區域形成的空間組成。此外，它被緊密的連接復合體所劃分，微絨毛位于小管腔的內部。同樣，HLO的透射電鏡分析證實肝細胞樣細胞之間存在膽管樣結構(圖3B，左)。

透射電鏡分析還顯示，HLO含有指向管腔的微絨毛(圖3B，右)。免疫組織化學分析顯示，MDR3、MRP2、BSEP和ZO-1染色了腔內內膜，表明這些HLOs具有極化特征。與這些解剖特征一致，qPCR分析顯示HLOs具有BSEP和NTCP基因表達(圖1F)。因此，HLOs包含從內腔中分離出來的極化的人肝細胞，被小管樣結構包圍，這反映了一種獨特的微觀解剖結構，類似于活體肝組織。

圖3 HLO的結構剖面

5、人肝類器官膽汁酸的產生和轉運特性

接下來，為了確定膽汁酸的生產能力，本文的研究人員對從類器官培養中收集的腔內液進行了膽汁酸酶聯免疫吸附試驗。如圖1F和3A所示，催化膽固醇分解代謝和膽汁酸合成第一步的CYP7A1在HLOs中分別表達陽性，染色陽性，提示HLOs中膽汁酸合成途徑被激活。腔內液總膽汁酸池的水平為26.7μg/d/106個細胞(單個直徑為200 μm的HLO為125 μmol/L)(圖4A)，令人驚訝的是，膽汁酸濃度與之前報道的夾層培養的原代肝細胞相當(40μg/d/106個細胞，培養上清為10 μmol/L)。膽汁酸排泄是膽汁流動的主要決定因素，因此，該系統的缺陷可能導致膽汁分泌受損(膽汁淤積)，并與各種肝臟疾病病理相關。

位于肝細胞頂端(小管)膜的外排轉運蛋白在肝臟清除許多內源性和外源性化合物(包括藥物和代謝物)中發揮重要作用。BSEP和MRP2調節人體小管膽鹽運輸。由于圖3A中膽汁轉運關鍵蛋白的陽性表達，本文的研究人員接下來想知道HLO是否能主動將膽汁酸轉運到其腔內。為了監測HLOs中膽汁運輸活性的動態變化，采用雙醋酸熒光素(FD)，在體外研究了從竇膜到膽小管膜的主動運輸機制[11]。用FD孵育的HLOs顯示，FD在45分鐘內被輸送到HLOs內部，并依次改變強度(圖4B)。此外，發現熒光膽汁酸CLF和膽鹽類似物膽酰酰氨基熒光素(分別是膽汁酸運輸活性指標和膽鹽類似物可重復地從體外排泄并積聚到HLOs腔內(補充圖5A和B)。

為了更深入地確定特異性，本文的研究人員利用CRISPR-Cas9基因編輯開發了一個iPSC系，該系攜帶一個去功能化的BSEP等位基因(圖4C)。雖然BSEP突變的iPSC-HLO的形態與對照HLO相似(圖4D)，但與親代對照HLO相比，BSEP突變的HLO未能積累熒光膽汁酸(圖4E)。類似地，化學BSEP抑制劑sitaxentan在可行劑量下抑制正常HLOs中的CLF運輸(圖4F和G)。這些數據表明，HLOs具有從外部攝取膽汁酸并將其排出HLO內部的能力。因此，HLOs不僅具有小管樣形態，而且具有膽汁酸產生和分泌活性。

圖4 膽汁在HLO中的轉運特性

6、人肝類器官高通量藥物誘導膽汁淤積評價

在藥物發現過程中，在DILI研究的早期階段，功能和可量化的分析對先導化合物的生成至關重要。然而，目前的模型的讀數過于簡單，例如，盡管涉及多種因素，如膽汁運輸缺陷，但只有生存能力。為了解決這些限制，本文的研究人員開發了基于384孔的高速實時成像平臺，本文的研究人員稱之為基于HLO的高通量毒性篩選(LoT)模型(圖5A)。本文的研究人員的LoT系統可以通過獨特的成像算法(圖5B)對每孔15-20個類器官進行評估，并對238種上市藥物進行了功能驗證，其中包括32種陰性對照藥物和206種報告的DILI化合物，它們具有4種不同的濃度，基于雙重數據:生存能力和膽固醇抑制功能。

在系統中，觀察到代表性的抑膽藥對CLF轉運的抑制作用。首先，與之前的報道相比，本文的研究人員篩選了對多劑量治療反應的生存能力(補充表1)。為了評估LoT系統的可預測性，本文的研究人員提取了補充圖1中列出的每種化合物的臨床最大藥物濃度(Cmax)值，并在最接近Cmax的濃度下分析數據。結果:敏感性和特異性分別為88.7%和88.9%(或69.0%和100%);并提供了與先前基于原代肝細胞模型的報告相當或更高的值(補充圖2和圖5C)。

有趣的是，吲哚美辛(Cmax: 8.3 μmol/L)和齊流通 (Cmax: 13.12 μmol/L)分別在10 μmol/L和100 μmol/L的細胞毒實驗中成功檢測到毒性，而這兩種藥物在其他平臺上很難檢測到[19,20]。其中，已知誘導膽汁淤積的藥物傾向于降低CLF強度，這表明可以在類器官成像分析中模擬顯著的膽汁轉運抑制作用(補充表3和圖5D)?？傊疚牡难芯咳藛T在這里開發的LoT系統由于其吞吐量和與人類數據的相關性，有可能用于早期藥物發現過程。

圖5 LoT篩選可識別具有潛在毒性的化合物

7、基于肝類器官的高通量毒性篩選系統對藥物性肝損傷化合物機制分類的研究

接下來，本文的研究人員著手建立一個使用類器官的深入調查模型。為了監測線粒體膜電位(MMP)線粒體健康以及膽汁運輸，本文的研究人員在完整的類器官中重復讀數。在確定了10種美國食品和藥物管理局批準的不影響生存能力的藥物的最佳劑量后(補充結果和補充圖6)，本文的研究人員用MMP量化線粒體健康評估。用訓練化合物(TCs)治療24小時后，觀察到托卡酮(2-8倍變化，P < 0.01)、雙氯芬酸(7- 13倍變化，P < 0.05或0.01)、環孢素A(3- 7倍變化，P < 0.01)和奈法唑酮(4- 42倍變化，P < 0.01)治療后的MMP的劑量依賴性增加(圖6A-C)。

此外，曲格列酮也增加HLO患者的MMP(3- 5倍變化，P < 0.05)，但未觀察到劑量依賴性。另一方面，在波生坦、恩他卡彭和吡格列酮治療后，即使多劑量也沒有明顯觀察到MMP的增加。

人類DILI的嚴重表現是多因素的，并且與已知的DILI機制(如線粒體和BSEP抑制)的組合高度相關。本文的研究人員進一步分析了存活、膽汁淤積和線粒體應激之間的關系。為了將本文的研究人員的毒性試驗與傳統的體外試驗系統進行比較，本文的研究人員根據已發表的關于原代肝細胞系統的膽汁淤滯毒性和線粒體應激的報告，選擇了TCs及其濃度。值得注意的是，與托爾卡彭、雙氯芬酸和波生坦相比，24小時雙效藥物(膽堿抑制和線粒體應激)，如環孢素A、曲格列酮和奈法唑酮，在72小時顯著降低細胞活力(圖6D和補充圖6A)。

這些數據與臨床數據相當，表明雙重效力與DILI的嚴重程度高度相關，這與以前的報告一致。此外，本文的研究人員還注意到，130μmol/L的恩他卡彭處理降低了類器官活力(從24小時的85%降至72小時的64%)。恩塔卡彭需要廣泛的結合血漿蛋白，主要是白蛋白，誘導DILI。利用LoT系統進一步研究恩他卡酮除膽汁淤積和線粒體健康外的毒性機制將是有趣的，因為毒性機制尚未明確。綜上所述，LoT系統是DILI主要機制分類的有用人體模型系統，也是進一步描述未知復雜機制的測試平臺。

眾所周知，DILI的發病率常常與許多宿主因素相混淆。例如，越來越多的證據表明，當與某些藥物(如對乙酰氨基酚)聯合使用時，肥胖和非酒精性脂肪性肝病會大大增加嚙齒動物和人類的肝毒性風險。因此，即使患者處于亞臨床階段，在如此“脆弱”的情況下，預測DILI的潛力似乎很重要。

在這里，本文的研究人員建立了脂毒性類器官模型通過暴露于不飽和脂肪酸油酸中(圖6E)。在油酸處理3天后，HLOs中的脂質積累非常強烈(圖6E)。脂肪酸的氧化是活性氧(ROS)的重要來源，它導致5′-三磷酸腺苷和煙酰胺二核苷酸的耗竭，并誘導脂肪肝DNA損傷。與此一致的是，脂質處理的HLOs中ROS的生成增加(圖6F和補充圖7A)。此外，脂肪酸誘導肝臟線粒體大量腫脹(圖6F和補充圖7B)，類似于已發表的表型。

由于這種脂毒性類器官模型是ROS增加的脆弱狀態，因此采用2噻唑烷二酮、曲格列酮(0-50μmol/L)和吡格列酮(200μmol/L)處理HLOs 24小時，并評估細胞活力。本文的研究人員觀察到，在脂毒性條件下，使用曲格列酮治療后，由于細胞死亡導致類器官大量碎裂(補充圖8)，隨后的細胞活力分析證實了這一點（與對照組相比，細胞存活率為40%，P < 0.05)(圖6G)。由于單獨使用吡格列酮治療不會影響有或沒有脂毒性的HLO的生存能力，因此脂毒性HLO可能突出DILI易損性，具有陽性和陰性的預測能力(圖6G)。

接下來，本文的研究人員研究了HLOs是否可以使用具有治療潛力的化合物從DILI樣疾病中恢復。為了證明這一概念，本文的研究人員使用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)來抑制ROS的產生，這是基于文獻報道，靜脈注射NAC可以提高非對乙酰氨基酚相關急性肝衰竭患者的生存率，并降低曲格列酮誘導的細胞毒性[28]。正如預期的那樣，NAC顯著提高了細胞活力，這表明即使在脆弱條件下，NAC也可以挽救HLOs中的細胞死亡(圖6G和補充圖8)。該LoT系統可能作為臨床前工具，在多藥方案下識別緩解DILI樣疾病的有效化合物。

8.CYP2C9*2誘導的多能干細胞肝類器官特異性波生坦誘導的膽汁淤積

由于藥物誘導的事件是高度可變的，基于ipsc的類器官方法有望用于個體敏感性的潛在評估[4]-。為了確定本文的研究人員的系統的臨床相關性，本文的研究人員使用了影響藥物誘導的膽汁轉運抑制潛力的藥物基因組學見解。

本文的研究人員對8種不同的iPSC系進行了基因分型，其中有或沒有眾所周知的易感基因變異(即CYP2C9*2活性中間體)，以波生坦誘導DILI，并比較了HLO系的膽汁抑制潛能。有趣的是，CLF向HLOs的排泄嚴重受損(陽性率:CC，陽性17.1%;在CY2C9*2攜帶者的HLOs中，波生坦的陽性率為70.8%，而在3種不含CYP2C9*2的ipsc衍生的HLOs中則沒有(圖7A-E)。

這些結果表明，基于類器官的膽汁淤積試驗對CYP2C9介導的藥物性膽汁淤積變異有陰性和陽性的預測，正如在人類中看到的那樣。這些結果表明，以類器官為基礎的膽汁淤積試驗預測了藥物引起的膽汁淤積的人類遺傳變異的某些方面。

圖6 采用DILI HLO模型的機械毒理學方法

圖7 波生坦誘導的膽汁淤積是CYP2C9*2 HLO特異性的

三、補充結果

9.大型類器官毒性系統對藥物性肝損傷化合物機制分類的回顧

由于線粒體毒性在與DILI發病相關的多種機制中在DILI中起核心作用，因此用MMP指數來描述HLO患者的線粒體健康狀況是有意義的[30]。為了監測MMP線粒體健康以及膽汁運輸，本文的研究人員對完整類器官的讀數進行了多重處理。在測試化合物陣列之前，本文的研究人員將MMP應用于具有FD的類器官中以檢測膽汁運輸活性，而不是熒光標記的膽汁酸CLF和膽酰甘酰胺熒光素，因為FD可以平行獲取MMP。與FD孵育的HLO在與MMP激活一致的較短動力學(20-45分鐘)中表現出相同的表型(圖4B)。然后，本文的研究人員做了注釋美國食品和藥物管理局批準了10種基于fd的檢測和MMP檢測的藥物。

首先，雖然本文的研究人員找到了9種化合物的最佳預死劑量，但在本文的研究人員的測試范圍內，胺碘酮對HLOs具有顯著毒性(補充圖6A);因此，本文的研究人員在進一步的潛在DILI評估研究中排除了胺碘酮，以避免細胞死亡引起的繼發性改變引起的噪音。根據DILI機制將9種tc分為3類:無膽汁淤積的DILI化合物(A類)、有膽汁淤積的DILI化合物(B類)和未報道為DILI化合物的化合物(C類)(Supplementary Figure 6B)。

為了量化FD排泄的抑制電位，本文的研究人員通過ImageJ量化了每個類器官內外的熒光強度比(補充圖5C)。為了確定最佳測量時間，本文的研究人員使用CSA測試了FD轉運抑制。在FD治療后5分鐘，CSA治療24小時組與對照組(DMSO)相比顯著下降(與對照組相比下降0.4)(補充圖5C)。用同樣的方法，本文的研究人員評估了9種不同濃度的TCs, B類化合物的FD外排明顯減少(P < 0.01或0.05);波生坦、CSA、曲格列酮和奈法唑酮與臨床觀察結果相似，而在A類和C類化合物中沒有觀察到這種抑制作用(圖6A和B)。

補充圖1 用于定量的HLOs圖像。圖像顯示HLO大小和形狀均勻

補充圖2 從多個多能干細胞生成HLO的穩健方案的發展

補充圖3 來自多個psc的HLO分析

補充圖4 HLOs的scRNA-seq分析

補充圖5 用探頭觀察膽汁轉運功能

補充圖6? 10種化合物處理后24小時的細胞活力

補充圖7 脂毒性肝類器官中ROS的產生和線粒體形態的改變

補充圖8 脂毒性類器官模型。無脂質堆積模型的形態學變化(上表)以及脂質和藥物治療情況

四、編者點評

人類成體干細胞衍生的肝類器官可以恢復成熟的肝細胞特征，從而可以在體內損傷的肝臟中重新填充。細胞內具有管腔和膽管樣結構的HLOs的形態與原代類器官既有異同又有相似之處。例如，iPSC-HLO顯示具有大管腔的中空樣結構，而原代組織包含具有小管雞絲狀外觀的細胞索。

然而，這兩個系統都包含管狀管腔，管狀管腔是由相鄰肝細胞相對質膜的修飾的頂端區域形成的空間，以及位于管腔內部的緊密連接復合物和微絨毛的分布?；蚓庉嫼退幬镆种苿┰囼炞C實膽汁酸類似物內化到HLO中使用BSEP，這是一種已知的膽汁酸排泄轉運蛋白?？紤]到通過scRNA-seq, HLO中一半的肝細胞樣細胞顯示不成熟狀態，與成人肝組織來源的基于類器官的方法相比，psc來源的HLO表現出相對不成熟的轉錄組特征，類似于其他已發表的研究。有趣的是，即使在妊娠早期，人類胎兒肝臟也已知具有功能性藥物代謝酶系統，這是人類而非動物特有的獨特特征。

此外，本文的研究人員的scRNA-seq鑒定的HLO群體亞群代表1區(肝臟門靜脈周圍區)和3區(肝臟小葉中心區)肝細胞樣細胞。HLO中未成熟和成熟的帶狀肝細胞之間的差異特征保證了未來的研究，以確定信號傳導邏輯，以繼續HLO中肝細胞樣細胞的成熟。

LoT測定的主要優點包括使用患者的iPSC，前腸階段的可儲存特性，測定通量，以及用于分析其他因素(如線粒體應激)之間相互作用的多路讀數。如上所述，回顧性研究表明，多種細胞應激電位與DILI[21]的發病率相關，LoT試驗顯示的結果與該研究相當，因為細胞活力降低依賴于雙重讀數:線粒體和膽汁沉積應激。

氧化應激在細胞死亡中起重要作用，并與膽汁淤積性肝損傷的發展有關。在膽汁淤積期間，疏水膽汁酸在細胞內積聚，干擾正常的線粒體電子傳遞，抑制呼吸復合物I和III的活性，從而減少腺苷5′三磷酸的合成，導致線粒體功能障礙誘導的細胞凋亡。

與這些發現一致，本文的研究人員對這兩個讀數的相關分析表明，與線粒體應激相比，膽汁淤積應激是肝損傷的更主要因素。值得注意的是，與基因變異相關的對波生坦的不同易感性被本文的研究人員使用多供體iPSC衍生的HLOs的LoT系統重演。由于原代肝組織取樣困難且效率低，特別是來自無疾病的健康個體的34例，因此，初步證明健康供者來源的iPSC來源的HLOs將是精準研究的有價值的工具CYP2C9*2載體鑒定。更重要的是，最近發展起來的具有基因測序數據的大規模iPSC庫將使本文的研究人員能夠建立一個與基因組分層相結合的可想象的群體。LoT可以作為制藥業的一項令人興奮的戰略，為最大限度地減少DILI的可能性提供必要的見解。

LoT系統目前是一個過度簡化的模型，缺乏適應性免疫成分。因此，為了充分預測其他類型的DILI，包括在患者中觀察到的特異性DILI和免疫介導性DILI，額外的修改是至關重要的。此外，本研究是在單一機構進行的。為了便于應用于臨床前毒理學分析，基于384孔的LoT篩選試驗需要在多個獨立機構進行盲法化合物試驗驗證，以進一步提高可重復性和可信度。盡管LoT檢測顯示在>8名供者中CYP2C9基因變異依賴性膽汁淤積加劇，但這一解釋不能排除供者依賴性差異的可能性，而不是基因型依賴性。為了證明兩者之間的因果關系，在iPSC中使用等基因堿基編輯方法將是非常有用的。

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