背景相關
由病原微生物引起的感染性疾病是臨床面臨的最常見的疾病之一，并且隨著人群結構變化、環境污染以及藥物濫用等因素的影響，病原體呈現多樣化和復雜化的趨勢，逐步威脅人類健康。?隨著測序技術的飛速發展，NGS已逐步應用于感染性疾病的診斷、治療和監測，在病原微生物鑒定、分型、耐藥突變檢測及新型病原體鑒定方面有其獨特的優勢。
病原微生物檢測現狀
快速準確的診斷可以對病情進行監控，提供有效治療，控制疾病的蔓延。目前常用的病原微生物分子檢測方法主要有：PCR技術（包括常規PCR以及qPCR），基因芯片技術，NGS測序技術。還有一些其他技術如質譜（MALDI-TOF-MS）等。
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方法 |
優點 |
局限 |
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PCR技術 |
靈敏度與特異性高，實現快速鑒定 |
須有潛在的目標病原菌，從而針對性檢測 |
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基因芯片 |
成本低，同時結合微機械技術，將樣本預處理核酸提取，擴增以及雜交后的檢測集成為一張芯片。 |
只能對于已知的病原體進行意向性篩查，無法檢測新的未知病原體 |
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NGS |
不依賴于已的核酸序列，不需額外設計探針.針對難以培養甚至無法分離培養的菌屬有顯著優勢。 |
拼接組裝的難點 |
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質譜技術 |
有效縮短了檢測周期，且操作相對簡便。且更能檢測到活躍狀態的病原微生物 |
只能檢測已有蛋白譜的微生物 |
NGS在病原微生物檢測的中的應用
1、感染性疾病病原體的鑒定
傳統的檢測方法主要有涂片鏡檢，生化反應和免疫學檢測等等，但存在周期長、過程復雜以及靈敏度低等特點。PCR技術的出現部分解決了上述的問題，但是難以解決未知微生物檢測的難題。而NGS檢測無需對病原體進行分離培養，也不依賴于已知的核酸序列設計引物等，可直接對標本進行測序鑒別，大大縮減建庫時間，提高診斷效率，尤其在未知病原微生物檢測方面有無與倫比的優勢。
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檢測方法 |
時長 |
特點 |
通量 |
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涂片鏡檢 |
數分鐘~數小時 |
快速檢查，無法精確判斷，主要作為初診手段。 |
低通量，單次檢測一種/類微生物 |
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生化反應 |
數小時~數天 |
針對特定微生物檢測 |
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免疫學檢測 |
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NGS |
1-3天 |
時間短，所有病原體一次檢出 |
高通量，單次檢出所有微生物 |
目前NGS在病原微生物鑒定方面主要有兩種形式：rRNA多樣性測序和全基因組測序，前者偏向細菌、真菌的鑒定以及菌群分析，后者獲取的信息更為全面，一般偏重病毒鑒定。
2、病原體耐藥及毒力特征檢測
在當前的抗生素不規范使用以及宿主免疫等重重壓力下，病原體勢必在毒性以及耐藥方面有進化。這種高毒性的以及高耐藥性的菌株往往是導致感染性疾病發病率、死亡率居高不下的重要原因。
臨床上耐藥性及毒性檢測方法主要是體外藥物敏感性試驗、耐藥菌表型檢測等方法。這些方法操作繁瑣，且較費時、費力。NGS技術通量高、快速，在一次測序反應中即可獲得細菌整個基因組的耐藥、毒力等相關基因信息，有助于揭示病原體毒力及耐藥機制，對臨床治療及指導用藥均具有重要意義。
3、病原體分型及流行溯源
目前病原體分型方法主要有多位點序列分型、脈沖場凝膠電泳、多位點串聯重復序列分析技術等。這些技術可檢測病原體的型別，但分辨率較低，對于相似或變異度極高的病原體如病毒等則難以區別。而?NGS則彌補了此項缺陷，通過檢測病原體全基因組序列，獲得全部遺傳信息，被認為是分辨率最高的病原體分型方法。
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病原體分型技術 |
優勢 |
局限性 |
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多位點序列分型（MLST） |
操作簡單，應用方便，可重復性強，易實現標準化，不同實驗室結果可比性高 |
分辨力較低，價格高昂 |
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脈沖場凝膠電泳（PFGE） |
分辨率較高，可重復性強 |
操作繁瑣，周期較長，設備昂貴，實驗室間可比性較差 |
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多位點串聯重復序列分析（MLVA） |
分辨力較高，成本低，操作簡易 |
引物設計繁瑣，實驗室間可比性較差實驗室間可比性較差，計算結果準確性不高 |
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NGS（主要是WGS） |
分辨力極高 |
工作量大，周期長，價格高昂 |
近年來抗生素的不規范使用甚至濫用，使細菌耐藥情況日益突出，耐藥菌株在醫院內的暴發時有發生。NGS技術在對耐藥菌等病原體進行分型的基礎上，可以判斷同源性遠近，分辨不同的進化路線，成為追蹤病原體不可或缺的重要手段。
4.?腸道微生物菌群宏基因組測序分析
宏基因組學（Metagenomics）：以微生物生態群落中所有微生物的基因組為研究對象，通過直接從環境樣本中提取全部微生物的DNA或者RNA構建宏基因組文庫，研究群落中物種組成和功能組成、同一個群體內不同微生物的相互作用、微生物群落與宿主之間的相互作用，并進行不同表型的樣品比較分析，來解釋生物學現象。
圖來源于Fields，Science. 2001,291,5507:1221-1224
近年來腸道微生物相關研究愈趨火熱，不少研究表明，腸道菌群與宿主共生共進化，在營養代謝等方面影響人體健康，腸道微生態失衡與人體諸多疾病存在密切關系。腸道微生物中關鍵功能菌更是有可能成為疾病診治的新型生物標志物和治療靶點。2015年《科學》雜志還發文呼吁發起“聯合微生物組計劃”。而NGS測序有望憑借其數據通量高、成本低、速度快的特點，成為研究腸道微生物和宏基因組學的有力工具。
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NGS在應用中面臨的主要挑戰
雖然NGS在病原微生物的檢測中有著明顯的優勢，但是也依然面臨不少挑戰：
l?參考數據庫的完整性
微生物檢測鑒定的準確性很大程度上取決于參考數據庫的范圍與完整性；
l?臨床標本的復雜性
臨床標本來源復雜多樣，可能存在病原體信息太少而導致數據丟失或病原體數據混雜在正常菌群中難以區分;
l?NGS測序技術的局限性
目前的分析質量依賴于測序質量、基因組組裝的質量以及參考基因組序列的選擇和質量；
l?質量控制和標準化
參考基因組的選擇，分型方法如何選擇等，目前尚未建立不同標本測序前處理和參數設置的統一標準。
文末小結：
NGS技術被認為是一種極具應用前景的實驗技術，盡管依然路途艱辛，但隨著測序成本的降低以及測序技術的進步，相比較于其他的檢測方法，NGS在病原微生物檢測行業的優勢逐漸凸顯，必將成為臨床診斷的有力工具。目前國內的基因檢測市場空間巨大，臨床醫師也越來越認識到這項技術的價值，加上目前初始階段的從業者們在參考數據庫構建等方面的持續耕耘，病原微生物基因檢測市場有更廣闊的空間亟待發掘。
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2?樣本適用范圍廣：適用于痰液，腹水，腦脊液，FFPE等各類樣本；
2?適用場景更廣泛：自動化建庫平臺首選；
2?酶切可控時間長：僅需調整酶切時間即可得到目標片段；
2?耐抑制物能力強：對于復雜樣本中的一些抑制物有更好的耐受能力。
微生物實戰案例：
客戶單位：數據來源于上海某生物公司D*
實驗樣本：痰液，腹水
實驗結論：不同模板的質量不均一，采用不同的酶切時間可獲得優質文庫。
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