背景相關(guān)
由病原微生物引起的感染性疾病是臨床面臨的最常見的疾病之一，并且隨著人群結(jié)構(gòu)變化、環(huán)境污染以及藥物濫用等因素的影響，病原體呈現(xiàn)多樣化和復(fù)雜化的趨勢(shì)，逐步威脅人類健康。?隨著測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，NGS已逐步應(yīng)用于感染性疾病的診斷、治療和監(jiān)測(cè)，在病原微生物鑒定、分型、耐藥突變檢測(cè)及新型病原體鑒定方面有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。
病原微生物檢測(cè)現(xiàn)狀
快速準(zhǔn)確的診斷可以對(duì)病情進(jìn)行監(jiān)控，提供有效治療，控制疾病的蔓延。目前常用的病原微生物分子檢測(cè)方法主要有：PCR技術(shù)（包括常規(guī)PCR以及qPCR），基因芯片技術(shù)，NGS測(cè)序技術(shù)。還有一些其他技術(shù)如質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）等。
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方法 |
優(yōu)點(diǎn) |
局限 |
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PCR技術(shù) |
靈敏度與特異性高，實(shí)現(xiàn)快速鑒定 |
須有潛在的目標(biāo)病原菌，從而針對(duì)性檢測(cè) |
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基因芯片 |
成本低，同時(shí)結(jié)合微機(jī)械技術(shù)，將樣本預(yù)處理核酸提取，擴(kuò)增以及雜交后的檢測(cè)集成為一張芯片。 |
只能對(duì)于已知的病原體進(jìn)行意向性篩查，無法檢測(cè)新的未知病原體 |
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NGS |
不依賴于已的核酸序列，不需額外設(shè)計(jì)探針.針對(duì)難以培養(yǎng)甚至無法分離培養(yǎng)的菌屬有顯著優(yōu)勢(shì)。 |
拼接組裝的難點(diǎn) |
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質(zhì)譜技術(shù) |
有效縮短了檢測(cè)周期，且操作相對(duì)簡(jiǎn)便。且更能檢測(cè)到活躍狀態(tài)的病原微生物 |
只能檢測(cè)已有蛋白譜的微生物 |
NGS在病原微生物檢測(cè)的中的應(yīng)用
1、感染性疾病病原體的鑒定
傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要有涂片鏡檢，生化反應(yīng)和免疫學(xué)檢測(cè)等等，但存在周期長(zhǎng)、過程復(fù)雜以及靈敏度低等特點(diǎn)。PCR技術(shù)的出現(xiàn)部分解決了上述的問題，但是難以解決未知微生物檢測(cè)的難題。而NGS檢測(cè)無需對(duì)病原體進(jìn)行分離培養(yǎng)，也不依賴于已知的核酸序列設(shè)計(jì)引物等，可直接對(duì)標(biāo)本進(jìn)行測(cè)序鑒別，大大縮減建庫時(shí)間，提高診斷效率，尤其在未知病原微生物檢測(cè)方面有無與倫比的優(yōu)勢(shì)。
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檢測(cè)方法 |
時(shí)長(zhǎng) |
特點(diǎn) |
通量 |
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涂片鏡檢 |
數(shù)分鐘~數(shù)小時(shí) |
快速檢查，無法精確判斷，主要作為初診手段。 |
低通量，單次檢測(cè)一種/類微生物 |
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生化反應(yīng) |
數(shù)小時(shí)~數(shù)天 |
針對(duì)特定微生物檢測(cè) |
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免疫學(xué)檢測(cè) |
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NGS |
1-3天 |
時(shí)間短，所有病原體一次檢出 |
高通量，單次檢出所有微生物 |
目前NGS在病原微生物鑒定方面主要有兩種形式：rRNA多樣性測(cè)序和全基因組測(cè)序，前者偏向細(xì)菌、真菌的鑒定以及菌群分析，后者獲取的信息更為全面，一般偏重病毒鑒定。
2、病原體耐藥及毒力特征檢測(cè)
在當(dāng)前的抗生素不規(guī)范使用以及宿主免疫等重重壓力下，病原體勢(shì)必在毒性以及耐藥方面有進(jìn)化。這種高毒性的以及高耐藥性的菌株往往是導(dǎo)致感染性疾病發(fā)病率、死亡率居高不下的重要原因。
臨床上耐藥性及毒性檢測(cè)方法主要是體外藥物敏感性試驗(yàn)、耐藥菌表型檢測(cè)等方法。這些方法操作繁瑣，且較費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。NGS技術(shù)通量高、快速，在一次測(cè)序反應(yīng)中即可獲得細(xì)菌整個(gè)基因組的耐藥、毒力等相關(guān)基因信息，有助于揭示病原體毒力及耐藥機(jī)制，對(duì)臨床治療及指導(dǎo)用藥均具有重要意義。
3、病原體分型及流行溯源
目前病原體分型方法主要有多位點(diǎn)序列分型、脈沖場(chǎng)凝膠電泳、多位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列分析技術(shù)等。這些技術(shù)可檢測(cè)病原體的型別，但分辨率較低，對(duì)于相似或變異度極高的病原體如病毒等則難以區(qū)別。而?NGS則彌補(bǔ)了此項(xiàng)缺陷，通過檢測(cè)病原體全基因組序列，獲得全部遺傳信息，被認(rèn)為是分辨率最高的病原體分型方法。
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病原體分型技術(shù) |
優(yōu)勢(shì) |
局限性 |
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多位點(diǎn)序列分型（MLST） |
操作簡(jiǎn)單，應(yīng)用方便，可重復(fù)性強(qiáng)，易實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，不同實(shí)驗(yàn)室結(jié)果可比性高 |
分辨力較低，價(jià)格高昂 |
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脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE） |
分辨率較高，可重復(fù)性強(qiáng) |
操作繁瑣，周期較長(zhǎng)，設(shè)備昂貴，實(shí)驗(yàn)室間可比性較差 |
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多位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列分析（MLVA） |
分辨力較高，成本低，操作簡(jiǎn)易 |
引物設(shè)計(jì)繁瑣，實(shí)驗(yàn)室間可比性較差實(shí)驗(yàn)室間可比性較差，計(jì)算結(jié)果準(zhǔn)確性不高 |
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NGS（主要是WGS） |
分辨力極高 |
工作量大，周期長(zhǎng)，價(jià)格高昂 |
近年來抗生素的不規(guī)范使用甚至濫用，使細(xì)菌耐藥情況日益突出，耐藥菌株在醫(yī)院內(nèi)的暴發(fā)時(shí)有發(fā)生。NGS技術(shù)在對(duì)耐藥菌等病原體進(jìn)行分型的基礎(chǔ)上，可以判斷同源性遠(yuǎn)近，分辨不同的進(jìn)化路線，成為追蹤病原體不可或缺的重要手段。
4.?腸道微生物菌群宏基因組測(cè)序分析
宏基因組學(xué)（Metagenomics）：以微生物生態(tài)群落中所有微生物的基因組為研究對(duì)象，通過直接從環(huán)境樣本中提取全部微生物的DNA或者RNA構(gòu)建宏基因組文庫，研究群落中物種組成和功能組成、同一個(gè)群體內(nèi)不同微生物的相互作用、微生物群落與宿主之間的相互作用，并進(jìn)行不同表型的樣品比較分析，來解釋生物學(xué)現(xiàn)象。
圖來源于Fields，Science. 2001,291,5507:1221-1224
近年來腸道微生物相關(guān)研究愈趨火熱，不少研究表明，腸道菌群與宿主共生共進(jìn)化，在營(yíng)養(yǎng)代謝等方面影響人體健康，腸道微生態(tài)失衡與人體諸多疾病存在密切關(guān)系。腸道微生物中關(guān)鍵功能菌更是有可能成為疾病診治的新型生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。2015年《科學(xué)》雜志還發(fā)文呼吁發(fā)起“聯(lián)合微生物組計(jì)劃”。而NGS測(cè)序有望憑借其數(shù)據(jù)通量高、成本低、速度快的特點(diǎn)，成為研究腸道微生物和宏基因組學(xué)的有力工具。
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NGS在應(yīng)用中面臨的主要挑戰(zhàn)
雖然NGS在病原微生物的檢測(cè)中有著明顯的優(yōu)勢(shì)，但是也依然面臨不少挑戰(zhàn)：
l?參考數(shù)據(jù)庫的完整性
微生物檢測(cè)鑒定的準(zhǔn)確性很大程度上取決于參考數(shù)據(jù)庫的范圍與完整性；
l?臨床標(biāo)本的復(fù)雜性
臨床標(biāo)本來源復(fù)雜多樣，可能存在病原體信息太少而導(dǎo)致數(shù)據(jù)丟失或病原體數(shù)據(jù)混雜在正常菌群中難以區(qū)分;
l?NGS測(cè)序技術(shù)的局限性
目前的分析質(zhì)量依賴于測(cè)序質(zhì)量、基因組組裝的質(zhì)量以及參考基因組序列的選擇和質(zhì)量；
l?質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化
參考基因組的選擇，分型方法如何選擇等，目前尚未建立不同標(biāo)本測(cè)序前處理和參數(shù)設(shè)置的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。
文末小結(jié)：
NGS技術(shù)被認(rèn)為是一種極具應(yīng)用前景的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，盡管依然路途艱辛，但隨著測(cè)序成本的降低以及測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，相比較于其他的檢測(cè)方法，NGS在病原微生物檢測(cè)行業(yè)的優(yōu)勢(shì)逐漸凸顯，必將成為臨床診斷的有力工具。目前國(guó)內(nèi)的基因檢測(cè)市場(chǎng)空間巨大，臨床醫(yī)師也越來越認(rèn)識(shí)到這項(xiàng)技術(shù)的價(jià)值，加上目前初始階段的從業(yè)者們?cè)趨⒖紨?shù)據(jù)庫構(gòu)建等方面的持續(xù)耕耘，病原微生物基因檢測(cè)市場(chǎng)有更廣闊的空間亟待發(fā)掘。
明星產(chǎn)品推薦：
OnePot系列DNA建庫試劑盒是針對(duì)illumina平臺(tái)定向研發(fā)的酶切法建庫試劑盒，擺脫了繁瑣的超聲流程，采用酶切法建庫。精簡(jiǎn)實(shí)驗(yàn)流程，建庫更快，成本更低，且兼容自動(dòng)化建庫平臺(tái)，是病原微生物檢測(cè)的絕佳“助手”。
主要特點(diǎn)：
2?實(shí)驗(yàn)流程更精簡(jiǎn)：片段化/末修/加A一步完成，大大縮減建庫時(shí)間；
2?樣本適用范圍廣：適用于痰液，腹水，腦脊液，FFPE等各類樣本；
2?適用場(chǎng)景更廣泛：自動(dòng)化建庫平臺(tái)首選；
2?酶切可控時(shí)間長(zhǎng)：僅需調(diào)整酶切時(shí)間即可得到目標(biāo)片段；
2?耐抑制物能力強(qiáng)：對(duì)于復(fù)雜樣本中的一些抑制物有更好的耐受能力。
微生物實(shí)戰(zhàn)案例：
客戶單位：數(shù)據(jù)來源于上海某生物公司D*
實(shí)驗(yàn)樣本：痰液，腹水
實(shí)驗(yàn)結(jié)論：不同模板的質(zhì)量不均一，采用不同的酶切時(shí)間可獲得優(yōu)質(zhì)文庫。
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產(chǎn)品信息：