自從我國加入了WTO后，動物福利問題一度成為我國與世界接軌的一個瓶頸，并引起越來越多的關注。根據《歐盟動物保護法》提出的3R原則，越來越多的非動物模型被人們熟知并使用。因此，更多的科學研究開始使用非動物模型結合動物模型進行體內和體外研究。
在過去的十幾年里，斑馬魚（Danio rerio）在科學研究中的使用增長非常迅速。最初，因為斑馬魚胚胎通體透明，發育迅速且是一種脊椎動物發育的模型而受到廣泛使用。而現如今，由于5天以內的斑馬魚胚胎和幼魚自帶卵黃囊，無須進食，符合3R原則，斑馬魚實驗更受歡迎。因此，斑馬魚模型的應用正在擴展到其他領域，例如藥物、保健食品的機制研究、疾病模型臨床研究及新興藥物研發等等。
那么，斑馬魚模型結合哺乳動物模型進行保健食品功能的研究的優勢如何呢？本文將從中樞及免疫相關、減肥及降三高相關、口服美容相關、消化系統相關、機體損傷相關五大類別簡述斑馬魚模型結合哺乳動物模型在保健食品功能研究方向的應用。
圖注：《允許保健食品聲稱的保健功能目錄非營養素補充劑（2023年版）》五大分類歸納
01、中樞及免疫相關
1.1 免疫系統
硬骨魚是目前已知的最低等且兼具固有與適應性免疫系統的脊椎動物。斑馬魚造血機制研究的結果表明，人類與斑馬魚在免疫系統的細胞組成上極為相似。另外，斑馬魚的免疫器官與哺乳動物有所不同[1]。斑馬魚的適應性免疫系統在受精后的4-6周后才出現，胚胎發育中出現了一個僅具有固有免疫的特殊時期。斑馬魚的腎是免疫細胞發生的主要器官，類似于人類的骨髓，并在其中發現有T細胞、B細胞及樹突狀細胞的存在。
斑馬魚具有類似哺乳動物的胸腺皮質結構Thymoids，其腎臟與胸腺一起構成斑馬魚的中樞免疫器官。在哺乳動物上，淋巴結是抗原遞呈細胞（Antigen presenting cells，APCs）與淋巴細胞進行信息交換的重要場所。雖然斑馬魚缺乏淋巴結，但其脾、肝和腸可代替淋巴結作為APCs與淋巴細胞交換信息的場地，從而構成次級免疫器官。因此，斑馬魚模型具備發育完善的免疫系統，但由于針對斑馬魚的抗體標記等技術尚未普及，對其免疫功能調節的相關功效分析方法還不成熟。
哺乳動物的免疫系統主要分為兩個部分：先天性免疫和適應性免疫。先天性免疫系統是哺乳動物通過遺傳獲得的，并且在生命早期就已經發育成熟，包括固有免疫細胞如：巨噬細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞、嗜酸性粒和乙酰膽堿受體細胞等非特異性免疫細胞，主要負責直接識別和清除外來病原體。而適應性免疫系統則通過“記憶"機制進行工作：一旦身體感染某種病原體后，適應性免疫系統中的各類特異性免疫細胞就會產生“記憶"，從而能夠更好地預防同類病原體重復感染。小鼠是常用的免疫反應模型動物，比如遲發型變態反應模型，但該模型在小鼠上表現不規律，且缺乏人類典型的表皮過敏反應。除此之外，小鼠也能誘導速發型變態反應模型，表現為循環不暢，循環性虛脫等全身性過敏反應，常在幾小時甚至10到20分鐘死亡。而大鼠免疫模型相對斑馬魚的特點在于血液中可檢出反應素抗體IgE：常規的免疫法只能使大鼠產生少量反應素，在體內存在的時間較短，但蠕蟲感染等刺激性抗原常能誘發大鼠體內產生大量的IgE抗體，所以應該因地制宜地進行模型構建。
因此，可以利用斑馬魚模型進行大量保健食品增強免疫力功效的初篩，結合哺乳動物不同疾病模型靶向精準地進行相關免疫功效機制的研究。
1.2 視覺系統
斑馬魚胚胎期的視覺系統發育非常迅速，5dpf的幼魚具有非常成熟的視覺系統和視覺介導的行為。同時，斑馬魚還具有與人類相似的錐形視網膜和色彩視覺。因此，可以利用斑馬魚對眼毒性和視功能進行評價[2]。
研究人員通常采用眼動反應和視動反應對斑馬魚的視覺功能進行分析。眼動反應和視動反應均屬于視覺刺激誘發性行為，無需訓練即可誘導產生，人類亦具有以上兩種反應。已有研究表明斑馬魚檢測眼毒性的準確性高達70%[3]。lumican基因編碼光蛋白聚糖，是鞏膜細胞外基質的重要組成成分，對鞏膜生長代謝及維持鞏膜正常結構具有重要調節作用。近視眼鞏膜的重塑與鞏膜細胞外基質的活動明顯相關，lumican基因缺失，會造成鞏膜過度擴張。斑馬魚lumican基因沉默可很好地復現近視表型。
圖片來源：環特生物
常見視覺缺陷模型動物的眼球結構和發育特點存在差異，以致其在視覺研究中的認可度不高。人類視網膜包含視桿細胞和三個視錐光感受器亞型，對藍光、綠光或紅光敏感，這意味著人類是三色光。但斑馬魚是晝夜四色動物，具有對紫外線、藍光、綠色和紅光敏感的視錐光感受器。斑馬魚視網膜富含視錐細胞并且具有相同的感光器類型，發育中的斑馬魚視網膜在受精后2.5 dpf表達視蛋白，幼魚可對5 dpf的視覺刺激做出反應。所以斑馬魚和人類視網膜之間的相似性，因此越來越多的科學研究使用斑馬魚模型進行視力缺陷研究。
目前C57BL/6J小鼠和有色豚鼠是應用廣泛、成本較低的視覺缺陷哺乳動物模型。小鼠眼球結構與人類相似，同時具有完整的基因組信息和成熟的基因操控方法，但是小鼠眼球小，屈光介質的光學質量差，一般需要步進電機式光學相干斷層掃描儀等設備才可準確測量小鼠的活體眼球參數。另一方面，豚鼠眼球發育的過程也與人類高度相似，且眼球較大，更有利于眼部參數的測量，但豚鼠飼養過程中需注意及時補充維生素及維持飼養環境清潔。
1.3 中樞系統
斑馬魚大腦系統在生理學、腦解剖學和神經化學方面都與人類的特征基本相同。魚類大腦中沒有類似哺乳動物的海馬體結構或三突觸回路的區域，但硬骨魚的側腦皮層被認為與哺乳動物海馬相似，已經被證明能夠獲得和記憶空間信息。內側大腦皮層已經被發現在功能上和在某種程度上與哺乳動物的杏仁核（恐懼和其他情緒的中心）相似。斑馬魚不僅表現出短期記憶，而且還表現出長期記憶，以及聯想和社會學習，斑馬魚是研究學習和記憶的生物機制的最佳模式生物之一。與人類相當的行為表現如運動活動、焦慮樣行為、學習、記憶保留、空間和物體識別、恐懼反應、社會偏好和互動等，都能在斑馬魚身上得到體現。
大小鼠具備高度發達的神經系統，主要表現在大腦和小腦體積相對斑馬魚更大，且腦表面存在皺褶以大幅增加了皮層的表面積，并能形成與人類神經系統近似的復雜結構，包括了高級神經活動中樞，神經元之間的復雜網絡結構，兩大腦半球之間的橫向神經纖維（即胼胝體）以及小腦半球等。因此，以大小鼠為代表的哺乳動物模型具備認知行為、情緒活動、學習記憶等高級神經活動的腦結構基礎。
整體來說，斑馬魚雖在幼魚時期神經發育尚不完善，無法完成精密行為檢測，但可以利用該模型進行神經系統多靶點的初篩，并結合哺乳動物模型對行為學及精準靶向機制進行深入研究。
02、減肥及降三高相關
體內脂質過多可引起肥胖、高血壓、糖尿病、冠心病、高脂血癥和睡眠呼吸暫停等疾病。哺乳動物因個體飼養固有成本，其肥胖癥模型很難用于高通量篩選。Jones等人先前提出了斑馬魚胚胎卵黃囊內的脂肪含量可以用作指標來篩選調節脂肪代謝的藥物[4]。他們用Nile Red染料來定量脂肪，檢測了一些已知的促進脂肪代謝的藥物，包括PPAR激動劑、乙型腎上腺素激動劑、SIRT-1激動劑和煙酸。結果顯示這些藥物都能促進斑馬魚的脂肪代謝，說明斑馬魚可以用于脂質類疾病的高通量篩選[5]。
哺乳動物的脂肪消化主要發生在胃和小腸中。其中胃部的胃酸和胃蛋白酶主要起到破壞脂肪細胞結構和降低脂肪粒子大小的作用，而經胰腺分泌至小腸內的胰島素和胰脂酶則是脂肪消化的關鍵。胰島素主要作用于脂肪細胞膜，使其通透性增加，從而促進脂肪酸的釋放。胰脂酶則通過水解脂肪酯的酯鍵，將脂肪分解為甘油和脂肪酸。此外，小腸壁上的微絨毛也具有吸收脂肪的功效，在營養吸收過程中，小腸絨毛長度增加也是評價脂肪吸收增量的一個重要病理學指標。
哺乳動物實驗通過評價血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯等指標來判定高血脂模型是否成立，相對于斑馬魚模型來說，哺乳動物模型的脂肪代謝途徑與人類更相似，而斑馬魚高血脂模型則具有可視化優勢。因此可以利用斑馬魚模型進行保健食品減脂降三高功效的高通量初篩，再結合哺乳動物靶向精準地進行相關功效評價與機制研究。
03、口服美容相關
斑馬魚表皮具有一定的滲透壓耐受范圍，超過耐受范圍將產生脫水現象，尾部面積也會變小，因此，使用高滲透溶液可以建立斑馬魚補水保濕的誘導模型。水通道蛋白（Aquaporin, AQP）廣泛存在于生物體的各組織部位，影響著生物體水代謝的過程。AQP3在表皮基底及棘突層的角質形成細胞質膜中高度表達，并在這些質膜中作為水、甘油運輸蛋白，促進皮膚水合作用。人類透明質酸合成酶是一類在透明質酸合成過程中發揮重要作用的酶，HAS3在表皮透明質酸的合成中起主要作用。分析斑馬魚尾部面積，檢測HAS3、AQP3基因表達量，可評價保濕功效。
圖片來源：環特生物
哺乳動物的皮膚由表皮和真皮組成，表皮的表層為角質層，包括了腺體、毛、角、爪、甲、蹄等結構，深層為活細胞組成的生發層。真皮由膠原纖維及彈性纖維的結締組織構成，這兩種纖維交錯排列，其間分布有各種結締組織細胞、感受器官、運動神經末梢及血管、淋巴等。整體來說，大小鼠與人類除毛發長度外，在表皮與真皮結構上基本一致。但也因此大小鼠進行皮膚狀態的研究會極大地受到動物自身及環境的影響，比如其毛發生長速度會顯著影響透皮吸收效率。同時大小鼠存在日常自身清潔行為，對以涂抹給藥方式為主的化妝品實驗而言，如何讓受試樣品（尤其是有一定刺激性的）在其表皮停留24小時也是一個技術難點。
因此，推薦使用斑馬魚模型進行皮膚水分、痤瘡、黃褐斑等表型損傷以及安全性研究，利用哺乳動物模型進行皮膚表皮和真皮層細致的研究。
04、消化系統相關
斑馬魚沒有單獨的胃，食道較短，大部分為腸道。斑馬魚的消化系統和哺乳動物類似，斑馬魚的胰腺也分為外分泌腺和內分泌腺兩部分，由腺管連接到消化道。斑馬魚胰島的核心區域是產生胰島素的β細胞，周圍有產生胰高血糖素的α細胞、δ型細胞（產生促生長素抑制素）和ε細胞（產生生長素釋放肽）。主胰島在受精后24小時形成，第二胰島將在受精后5天左右開始形成，而后者是構成成魚胰腺的主要部分。已有研究表明斑馬魚內幾個基因的錯亂會影響β細胞的發展，而且在某些情況下，其表現出來的表型和人類相關疾病十分相似。Ng等研究發現[6]，斑馬魚在受精后5天，其腸道的管腔形成，并不斷生長，內胚層分化形成了有功能的腸道上皮。在未喂食時，斑馬魚胚胎的腸道即開始游走性蠕動。由于斑馬魚早期體外發育，全身透明，所以其胃腸蠕動均可直接觀察。
哺乳動物的消化系統包括消化管和消化腺。胃是哺乳動物消化道的重要部分，其形態常因食性的不同而變化。小腸起營養物質吸收作用。大腸保護和潤滑腸壁，以利糞便排出。消化腺哺乳動物的消化腺除3對唾液腺外，在橫隔后面，小腸附近還有肝臟和胰臟，分別分泌膽汁和胰液，注入十二指腸。肝臟除分泌膽汁外，還有貯存糖原、調節血糖，使多余的氨基酸脫氧形成尿及其他化合物，將某些有毒物質轉變為無毒物質，合成血漿蛋白質等功能。整體來說，哺乳動物模型的消化系統從器官分布和功能分類上都和人類高度一致，但相較于斑馬魚模型而言，可視化方面需要更復雜的設備進行影像學分析檢測。
因此，推薦使用斑馬魚模型進行腸道功能的研究，利用哺乳動物模型進行胃及腸道的研究。
05、機體損傷相關
5.1 骨骼
目前在骨骼研究領域已成功建立許多種類的動物骨骼模型，以骨質疏松模型為例，有報道的動物模型包括嚙齒類動物、兔、犬、靈長類動物以及硬骨魚類等。Fleming等人[7]在2005年通過對斑馬魚頭部骨骼發育的觀察證明斑馬魚模型可以用于篩選促進骨骼發育的藥物。至此?斑馬魚作為高效、快速、高通量篩選促進骨骼生長、治療骨科疾病藥物的體內模型受到研究人員關注。由于硬骨魚和人類在骨骼發育過程中的基因、信號通路有高度同源性，而且與其他的動物模型相比，斑馬魚具有個體小，適合高通量化學篩選、幼魚身體透明易于觀察骨骼發育的特點，所以近年來以斑馬魚為模型的骨骼研究逐漸成為這一領域的熱點[8]。
哺乳動物骨骼系統是由一系列骨組織和軟骨組成的硬組織。它為哺乳動物提供支撐、保護和運動的功能。哺乳動物的骨系統包括頭骨、脊柱、肋骨、前肢骨和后肢骨等部分。哺乳動物骨系統是一個復雜而精妙的結構，自身具有較強的抗感染及耐受手術的能力，且圍手術期易于管理，制作骨缺損模型具有一定優勢。但其不能完全模擬人類的骨骼重建過程，因此不宜用在研究骨骼系統的形態、功能和組織性質方面的實驗。
5.2 肝臟
肝臟是斑馬魚最大的腺體，斑馬魚在受精后72小時，斑馬魚肝臟的形態和功能全部發育完全。在斑馬魚肝臟中，存在多種與哺乳動物同源的脂質代謝酶，包括HMG-CoA合成酶和HMG-CoA裂解酶氧化物酶等[2]。人類過多攝入能量導致脂肪肝，因此通過喂養誘發構建斑馬魚肥胖模型與人類更接近。通過喂養高脂飼料等誘發的模型會出現體重、體質指數、甘油三酯、總膽固醇等表達升高的現象。采用油紅、尼羅紅和熒光探針方法可間接反映脂質含量，更直觀進行結果的反饋[9]。除此之外，飼喂高脂飲食還可構建斑馬魚肝纖維化模型。由于大多數肝纖維化相關蛋白在人類和斑馬魚之間是保守的，意味著在斑馬魚體內有與人體內相同的發揮活性的藥物分子靶標。且斑馬魚是胚胎透明的，可監測標記的單個細胞甚至整個肝。在體式顯微鏡下，斑馬魚幼魚早期肝纖維化主要表現為肝變小。隨著藥物處理時間延長，肝組織內出現膠原纖維沉積現象[10]。
常用于研究肝臟的哺乳動物有大鼠、小鼠、家兔等，其中包括飲食誘發（高脂飲食、高果糖飲食、蛋氨酸和膽堿缺乏飲食）、藥物誘發（鏈脲佐菌素、四氯化碳、脂多糖以及四環素）和特殊模型等，動物伴有軀干肥胖并出現肝脂肪變性增加及明顯的纖維化等現象。實驗動物喂食高脂飲食所構建的模型與人類普遍脂肪肝相似，尤其是組織學改變，如脂肪變性和肝細胞氣球樣變等相似。然而，飲食模型耗時普遍較長（30~45日的重復給樣周期），且個體實驗動物的攝入量差異和敏感度差異會使哺乳動物模型在表型上的一致度更低。
圖片來源：pixabay
綜上所述，我們建議在保健食品原料篩選、配方組合、功效初篩及功效展示等方向使用斑馬魚模型，在保健食品配方確定、功效驗證、藥代動力學研究、劑型比較、機制研究等方向使用哺乳動物模型。當然，通過使用斑馬魚模型結合哺乳動物模型研究保健食品的功效和安全性預測性將大大提升。
【技術咨詢】17364531293（微信同號）
參考文獻：
[1] 謝英,張力,劉樹鋒. 斑馬魚免疫學研究進展 [J]. 實驗動物科學, 2013, 30 (03): 50-53.
[2] 劉可春,孫晨,王希敏等. 斑馬魚模型在藥物早期安全性評價中的應用 [J]. 山東科學, 2014, 27 (05): 1-8+13.
[3] Richards FM, Alderton WK, Kimber GM, Liu Z, Strang I, Redfern WS, Valentin JP, Winter MJ, Hutchinson TH. Validation of the use of zebrafish larvae in visual safety assessment. J Pharmacol Toxicol Methods. 2008 Jul-Aug;58(1):50-8. doi: 10.1016/j.vascn.2008.04.002. Epub 2008 May 2. PMID: 18541443.
[4] Jones KS, Alimov AP, Rilo HL, Jandacek RJ, Woollett LA, Penberthy WT. A high throughput live transparent animal bioassay to identify non-toxic small molecules or genes that regulate vertebrate fat metabolism for obesity drug development. Nutr Metab (Lond). 2008 Aug 27;5:23. doi: 10.1186/1743-7075-5-23. PMID: 18752667; PMCID: PMC2531115.
[5] 辛勝昌,趙艷秋,李松等. 斑馬魚模型在藥物篩選中的應用 [J]. 遺傳, 2012, 34 (09): 1144-1152.
[6] Ng AN, de Jong-Curtain TA, Mawdsley DJ, White SJ, Shin J, Appel B, Dong PD, Stainier DY, Heath JK. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Dev Biol. 2005 Oct 1;286(1):114-35. doi: 10.1016/j.ydbio.2005.07.013. PMID: 16125164.
[7] Fleming A, Keynes R, Tannahill D. A central role for the notochord in vertebral patterning. Development. 2004 Feb;131(4):873-80. doi: 10.1242/dev.00952. Epub 2004 Jan 21. PMID: 14736741.
[8] 李振華,Deepa Alex,徐燕玲等. 斑馬魚:新型骨骼研究模式生物 [J]. 中藥藥理與臨床, 2010, 26 (03): 67-71. DOI:10.13412/j.cnki.zyyl.2010.03.026
[9] 劉露,楊志康,楊曉彤等.斑馬魚肥胖模型的構建及在降脂物質中應用進展[J].現代預防醫學,2021,48(14):2622-2625+2630.
[10] 王潔,馮馳,董武等.斑馬魚肝纖維化動物模型研究進展[J].中國實驗動物學報,2023,31(04):531-540.