ELISA試劑盒的那點事
酶聯免疫吸附測定，又稱酶聯免疫吸附試驗，即ELISA，是酶免疫測定技術中應用最廣的技術。1971年Engvall等人發表了使用ELISA定量測定IgG的文章，將1966年用于抗原定位的酶標抗體技術發展成液體標本中微量物質的測定方法。
一. ELISA的原理
ELISA原理是將抗原或抗體包被在固相載體上，利用抗原抗體特異性結合，檢測過程種，通常使用洗板的方式去除非結合物，最終酶促反應后的底物的顏色，對樣本中蛋白進行定性與定量。
ELISA常見主要試劑：
1.抗體；單抗特異性強，多抗結合性高，高端試劑盒需要高效的配對。
2.抗原；大多為重組蛋白,細胞因子和待測樣本，高效標準品需NIBSC/WHO校準。
3.顯色作用體系：首先辣根過氧化物酶（HRP）與常見底物TMB和OPD均可形成顯色體系，再者堿性磷酸酶(AP)的底物為對-**苯***可形成黃色底物，還有葡萄糖氧化酶（GOD）的葡萄糖氧化酶法形成特殊顯色，最后β-D-半乳糖苷（β-D-Gal）的底物為4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）可生成高強度熒光。
圖1.ELISA常用試劑示意圖
二. ELISA的類型
根據試劑的來源和樣本的情況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法，按照原理及操作，市面最常用的方法有：
1. 間接法ELISA：
是檢測抗體最常用的方法，原理為利用酶標記的二抗以檢測已與固相結合的受檢抗體，顯色測定。優勢在于待測一抗無需標記快速便捷。直接法ELISA與間接法ELISA相似，區別在于一抗酶標，檢測孵育也以抗原為主，但直接法ELISA的靈敏度有限，需權衡使用。
圖2:間接法ELISA示意圖
2. 夾心法ELISA：
又分為雙抗原夾心法和雙抗體夾心法ELISA，原理相似，用于檢測抗體或抗原含量。以雙抗體夾心法為例，捕獲抗體包被在固相載體上，加入抗原或待測樣本結合，后加入的檢測抗體結合在抗原上，形成三明治夾心形式。雙抗夾心法是市面最常見與方便分析的方法。
圖3:雙抗夾心法ELISA示意圖
3. 競爭法ELISA：
小分子抗原與半抗原的檢測方法常用競爭法ELISA，待檢樣本中抗原越多，被結合的酶標抗原的量會減少，彼此形成競爭負相關體系，顯色物質也就越少，根據顯色物質的比例可擬合得到待測抗原含量。
圖4:競爭法ELISA示意圖
4.其他方法：
a.免疫抑制法測ELISA：固相包被抗原，被檢樣本對底物顯色的抑制程度與樣本中所含抗原的量成正比，二者之差為待測抗原含量，原理類似與競爭法ELISA。
b.阻斷ELISA:目的檢測特異性抗體，也稱為競爭ELISA，原理為固相包被抗原，待測樣本與一抗酶標競爭孵育，待檢樣本中抗體越多，顯色越淺，反則反之。非洲豬瘟病毒抗體檢測試劑盒中涉及該法。
c.此外有用于檢測IgM抗體的抗體捕捉ELISA，有固相載體改變的Dot-ELISA（**纖維素膜）和C-ELISA（滌綸布），還有技術分類的TRFIA和多因子檢測等。
三. ELISA的評估
ELISA Kit的多指標決定了產品質量的優劣，優秀的試劑盒需要對如下6大項指標進行測定評估，分析如下：
1.準確性：
a.回收率：測定試劑盒對數據真實性的校準，過高或偏低會產生加樣和假性性的失準數據。
b.線性：測定試劑盒稀釋液與樣本微環境的的準確性，過高或偏低均會出現測定的偏差。
2.精確度：
a.板內精確度：評價單次實驗中，同一個已知濃度不同復孔的差異。
b.板間精確度：評價同一樣本，多次實驗的差異。
3.精密度：
最低檢測限：能顯著區分空白信號的最小信號值對應的最低濃度，用于評估試劑盒的靈敏度，值越低試劑盒靈敏度越高。
4.特異性：
a.交叉反應：評判特異性，不同分子與試劑盒抗體結合能力，交叉反應越大，特異性越差。
b.抗干擾能力：同源物的干擾，內源性物質對檢測系統的干擾。
5.天然樣本檢測性：
對天然樣本及合適的樣本類型檢測分析。對天然樣本類型確定，避免假陽性或假陰性結果。
6.穩定性：
試劑盒時效性和穩定性是對指標檢測的重要保障。穩定性越高，試劑盒存儲時間越久。
圖5：ELISA試劑盒產品分類
四. ELISA的應用
ELISA技術是特定靶標蛋白質定量的金標準，提供快速，穩定且易于分析的結果。可以對生物大分子/小分子的定量，對親和力測定評價或者篩選，還可對重組蛋白或細胞因子進行活性比對分析等運用。常應用于細胞因子，趨化因子，生長因子等檢測，同時應用于癌癥、干細胞、免疫學、神經學和信號轉導等研究領域的靶標。
圖6.ELISA的技術應用
在生物醫藥研究，細菌疾病和臨床診斷中，ELISA作為成熟免疫的檢測方法定量檢測出所需研究的細胞因子，抗原等物質，應用十分廣泛，了解ELISA并選擇合適的試劑盒，會讓研究事半功倍。