炎性乳腺癌(IBC)是一種高度侵襲性的惡性腫瘤，具有獨特的臨床和組織病理學(xué)特征，但其分子基礎(chǔ)尚未剖析清楚。
美國科學(xué)家評估了一個IBC細胞系A(chǔ)3250，它在小鼠異種移植瘤模型中再現(xiàn)了關(guān)鍵的IBC特征。研究者使用轉(zhuǎn)錄組RNA測序和Olink Target 96炎癥panel明確了A3250細胞表達高水平的CCL2趨化因子，且是驅(qū)動巨噬細胞擴張的關(guān)鍵因子，并間接促進了腫瘤的生長。總體，基于A3250的IBC模型將為探索IBC獨特生物學(xué)提供新的見解。研究成果以“High endogenous CCL2 expression promotes the aggressive phenotype of human inflammatory breast cancer”為題，發(fā)表在Nature Communication（中科院JCR一區(qū)，IF：14.919 ）上。
研究結(jié)果
1. 通過原發(fā)腫瘤分離建立了一種炎癥性乳腺癌A3250，具有侵襲轉(zhuǎn)移特性
A3250乳腺癌細胞系是從一個三陰性炎性乳腺癌（IBC）患者的原發(fā)腫瘤中分離并構(gòu)建的細胞系。STR分析證實該系是獨特的,任何現(xiàn)有STR譜的相似性低于55%。A3250細胞表現(xiàn)出比通常研究的三陰性乳腺癌（TNBC）系MDA-MB-231細胞更高的集落形成能力。A3250缺乏雌激素或孕激素受體(ER或PR)，HER2(人類表皮生長因子受體-2，ERBB2)mRNA水平與其他TNBC細胞系相當。與MCF7或BT474腫瘤相比，A3250原位腫瘤也缺乏ER、PR或HER2蛋白。這些數(shù)據(jù)證實A3250是TNBC細胞系。A3250人異種移植瘤模型顯示了人IBC關(guān)鍵的臨床和組織病理學(xué)特征，也保留了人類IBC的關(guān)鍵特征：A3250原位腫瘤會自發(fā)地轉(zhuǎn)移到多個器官，如在6周內(nèi)轉(zhuǎn)移到前哨淋巴結(jié)（腹股溝）或更遠的淋巴結(jié)（腋窩和肱）。A3250腫瘤也顯示出向肺和肝轉(zhuǎn)移的高發(fā)生率（89%）。研究表明，A3250來源的腫瘤再現(xiàn)了人類IBC的侵襲性轉(zhuǎn)移表型。
2. 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析揭示了A3250細胞中與炎癥相關(guān)的多種通路的激活
為了深入了解侵襲性IBC表型的潛在驅(qū)動因素，研究者對A3250細胞進行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。將A3250的基因表達譜與6個人TNBC細胞系（2個IBC和4個非IBC）進行了比較。分層聚類顯示，A3250細胞與SUM149 IBC細胞最接近。
IPA分析顯示，與MDA-MB-231細胞相比，A3250在與炎癥相關(guān)的通路中表現(xiàn)出顯著的富集，A3250有10個典型通路被激活，其中8個與炎癥相關(guān)。與IBC3相比，A3250顯示了與纖維化、EMT和細胞骨架等相關(guān)的通路的激活。與MDA-MB-231和IBC3相比，A3250中PI3/AKT信號通路和腫瘤微環(huán)境被激活，信號素信號通路失活。與SUM149相比，A3250僅顯示5條通路富集，其中與脂質(zhì)代謝和炎癥相關(guān)的LXR/RXR典型通路上調(diào)最為顯著。
基因集富集分析(GSEA)分析顯示，A3250與MDAMB-231相比有34個基因集顯著富集，與IBC3相比有31個基因集顯著富集，與SUM149相比有22個基因集顯著富集。在與炎癥相關(guān)的通路中，與MBA-MB-231、IBC3和SUM149相比，通過NF-κB的標志性“TNFA信號”在A3250中顯著富集。A3250相比MDA-MB-231和IBC3也存在JL6 JAK STAT3信號的富集。總體，IPA和GSEA分析表明A3250中多種炎癥通路的激活。
3. A3250 IBC腫瘤引起明顯的局部和全身炎癥
病理學(xué)家對IBC中炎癥浸潤的程度和意義有不同的看法，人們普遍認為炎癥是癌細胞堵塞真皮淋巴管的結(jié)果。因此，研究者試圖與淋巴管浸潤（LVI）相比，描述A3250腫瘤中炎癥細胞積累的動力學(xué)。免疫染色顯示炎癥細胞在腫瘤侵襲皮膚淋巴管之前就已經(jīng)積累了。豐富的炎癥細胞富集可能是由于腫瘤來源的細胞因子的積極招募，而不是由于腫瘤栓塞阻塞淋巴管引起的。免疫染色進一步顯示，在整個存活的A3250腫瘤和鄰近的真皮中，F(xiàn)4/80+巨噬細胞的密度非常高。注射后4周檢查了攜帶A3250腫瘤的小鼠的肺，H&E染色顯示肺結(jié)構(gòu)異常，其特征是密集的炎癥浸潤和肺泡結(jié)構(gòu)缺失。流式細胞結(jié)果顯示，與無腫瘤小鼠肺相比，Ly6Chi髓系細胞有增加趨勢、血液中總CD11b+細胞、Ly6Chi炎癥單核細胞和Ly6Ghi中性粒細胞的比例顯著增加。
4. CCL2在A3250細胞和人IBC中高表達
為了確定可能介導(dǎo)A3250腫瘤髓細胞招募的原因，研究者分析了A3250腫瘤和細胞mRNA-Seq結(jié)果中趨化因子的表達。A3250腫瘤的結(jié)果分析顯示，44個趨化因子中10個有表達，其中只有3個（CCL2、CXCL5和CCL20）在腫瘤（體內(nèi)）和細胞（體外）均高表達，而CCL2的表達量最高。隨后，研究者利用Olink Target 96炎癥panel檢測了A3250細胞上清中的趨化因子，其中CCL2、CXCL5和CCL20蛋白水平較高。研究者分析了包含41個人類IBC和55個非IBC的Van Laere芯片數(shù)據(jù)，以及包含25個IBC和57個非IBC 的Iwamoto數(shù)據(jù)。在兩個數(shù)據(jù)集中，IBC的CCL2中位數(shù)表達水平均顯著高于非IBC。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，人類IBC，如A3250，通常表現(xiàn)出較高的CCL2表達水平。
5. 趨化因子受體CCR2在A3250 IBC腫瘤模型的髓系細胞高表達
趨化因子CCL2通過CCR2發(fā)揮作用，CCR2是主要的趨化因子受體，介導(dǎo)單核細胞和巨噬細胞招募到炎癥部位。研究者檢測了CCR2在A3250腫瘤、肺和血液的白細胞中的表達情況。結(jié)果表明，血液中存在高水平的CCR2+炎癥單核細胞和高CCR2表達的髓系細胞與A3250腫瘤和肺轉(zhuǎn)移相關(guān)。雖然CCL2在A3250細胞中高表達，但其他激活CCR2的人類趨化因子(CCL7、CCL8、CCL13和CCL16)均未表達。這些發(fā)現(xiàn)表明，在A3250腫瘤模型中，CCL2作為關(guān)鍵的CCR2激動劑，并強烈提示CCL2在單核細胞和巨噬細胞招募到A3250原發(fā)和轉(zhuǎn)移位點中發(fā)揮重要作用。
6. CCL2敲低顯著降低了A3250腫瘤的生長、肺轉(zhuǎn)移和炎癥表型
為了研究CCL2在A3250腫瘤惡性表型中的功能，研究者對CCL2進行了shRNA敲低(KD)。CCL2敲低可顯著抑制腫瘤生長，同時IBC特征的皮膚炎癥也顯著減少。此外，CCL2敲低降低了肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生率和總體轉(zhuǎn)移負擔。大多數(shù)CCL2敲低腫瘤小鼠肺內(nèi)無大轉(zhuǎn)移，主要表現(xiàn)為彌散性腫瘤細胞，而對照組A3250腫瘤小鼠主要表現(xiàn)為大轉(zhuǎn)移。
CCL2敲低腫瘤免疫細胞的免疫染色顯示，腫瘤區(qū)域的CD45+細胞顯著減少，其中大部分是F4/80+巨噬細胞。腫瘤中CCL2的下調(diào)可減少巨噬細胞浸潤和全身炎癥。
7、 人IBC存在巨噬細胞的富集
最近的一項研究發(fā)現(xiàn)了基于不同免疫浸潤的不同人類TNBC（三陰性乳腺癌）亞型，從巨噬細胞富集到中性粒細胞富集。為了檢驗人類IBC是否富含巨噬細胞，研究者分析了41個人類IBC和55個非IBC的芯片數(shù)據(jù)。分層聚類顯示了兩類乳腺癌，分別為富集或不富集TAM（腫瘤相關(guān)巨噬細胞）基因。富集TAM基因的IBC樣本明顯多于未富集TAM基因的IBC樣本。免疫染色檢測巨噬細胞(CD68+)和中性粒細胞(CD66b+)顯示，高密度巨噬細胞出現(xiàn)在間質(zhì)和/或腫瘤細胞簇內(nèi)。該結(jié)果與基因表達分析表明人IBC存在巨噬細胞富集，也與研究者對A3250腫瘤的研究結(jié)果一致，進一步強調(diào)了A3250腫瘤模型與人IBC的相關(guān)性。
研究總結(jié)
本研究圍繞一個來源于三陰性炎性乳腺癌（IBC）的細胞系A(chǔ)3250進行了研究。A3250細胞及移植瘤模型顯示了人IBC關(guān)鍵的臨床和組織病理學(xué)特征。對A3250細胞和腫瘤的轉(zhuǎn)錄組RNA測序發(fā)現(xiàn)了顯著的炎性特征，結(jié)合Olink Target 96炎癥panel找到了一個在A3250細胞和腫瘤中高表達的趨化因子CCL2，該趨化因子在IBC的原發(fā)和轉(zhuǎn)移位點發(fā)揮關(guān)鍵作用。敲低CCL2可有效改善移植瘤小鼠的疾病特征。此外，研究者發(fā)現(xiàn)，在巨噬細胞是臨床IBC中的一個主導(dǎo)亞群，這意味著耗盡或靶向巨噬細胞的免疫治療策略可能是很有前途的IBC治療方法。總體，本研究的結(jié)果表明，基于A3250細胞的IBC腫瘤模型將幫助人類進一步了解IBC生物學(xué)，并有助于促進IBC靶向治療方法的開發(fā)。
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