炎性乳腺癌(IBC)是一種高度侵襲性的惡性腫瘤，具有獨(dú)特的臨床和組織病理學(xué)特征，但其分子基礎(chǔ)尚未剖析清楚。
美國(guó)科學(xué)家評(píng)估了一個(gè)IBC細(xì)胞系A(chǔ)3250，它在小鼠異種移植瘤模型中再現(xiàn)了關(guān)鍵的IBC特征。研究者使用轉(zhuǎn)錄組RNA測(cè)序和Olink Target 96炎癥panel明確了A3250細(xì)胞表達(dá)高水平的CCL2趨化因子，且是驅(qū)動(dòng)巨噬細(xì)胞擴(kuò)張的關(guān)鍵因子，并間接促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)。總體，基于A3250的IBC模型將為探索IBC獨(dú)特生物學(xué)提供新的見(jiàn)解。研究成果以“High endogenous CCL2 expression promotes the aggressive phenotype of human inflammatory breast cancer”為題，發(fā)表在Nature Communication（中科院JCR一區(qū)，IF：14.919 ）上。
研究結(jié)果
1. 通過(guò)原發(fā)腫瘤分離建立了一種炎癥性乳腺癌A3250，具有侵襲轉(zhuǎn)移特性
A3250乳腺癌細(xì)胞系是從一個(gè)三陰性炎性乳腺癌（IBC）患者的原發(fā)腫瘤中分離并構(gòu)建的細(xì)胞系。STR分析證實(shí)該系是獨(dú)特的,任何現(xiàn)有STR譜的相似性低于55%。A3250細(xì)胞表現(xiàn)出比通常研究的三陰性乳腺癌（TNBC）系MDA-MB-231細(xì)胞更高的集落形成能力。A3250缺乏雌激素或孕激素受體(ER或PR)，HER2(人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體-2，ERBB2)mRNA水平與其他TNBC細(xì)胞系相當(dāng)。與MCF7或BT474腫瘤相比，A3250原位腫瘤也缺乏ER、PR或HER2蛋白。這些數(shù)據(jù)證實(shí)A3250是TNBC細(xì)胞系。A3250人異種移植瘤模型顯示了人IBC關(guān)鍵的臨床和組織病理學(xué)特征，也保留了人類(lèi)IBC的關(guān)鍵特征：A3250原位腫瘤會(huì)自發(fā)地轉(zhuǎn)移到多個(gè)器官，如在6周內(nèi)轉(zhuǎn)移到前哨淋巴結(jié)（腹股溝）或更遠(yuǎn)的淋巴結(jié)（腋窩和肱）。A3250腫瘤也顯示出向肺和肝轉(zhuǎn)移的高發(fā)生率（89%）。研究表明，A3250來(lái)源的腫瘤再現(xiàn)了人類(lèi)IBC的侵襲性轉(zhuǎn)移表型。
2. 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析揭示了A3250細(xì)胞中與炎癥相關(guān)的多種通路的激活
為了深入了解侵襲性IBC表型的潛在驅(qū)動(dòng)因素，研究者對(duì)A3250細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。將A3250的基因表達(dá)譜與6個(gè)人TNBC細(xì)胞系（2個(gè)IBC和4個(gè)非IBC）進(jìn)行了比較。分層聚類(lèi)顯示，A3250細(xì)胞與SUM149 IBC細(xì)胞最接近。
IPA分析顯示，與MDA-MB-231細(xì)胞相比，A3250在與炎癥相關(guān)的通路中表現(xiàn)出顯著的富集，A3250有10個(gè)典型通路被激活，其中8個(gè)與炎癥相關(guān)。與IBC3相比，A3250顯示了與纖維化、EMT和細(xì)胞骨架等相關(guān)的通路的激活。與MDA-MB-231和IBC3相比，A3250中PI3/AKT信號(hào)通路和腫瘤微環(huán)境被激活，信號(hào)素信號(hào)通路失活。與SUM149相比，A3250僅顯示5條通路富集，其中與脂質(zhì)代謝和炎癥相關(guān)的LXR/RXR典型通路上調(diào)最為顯著。
基因集富集分析(GSEA)分析顯示，A3250與MDAMB-231相比有34個(gè)基因集顯著富集，與IBC3相比有31個(gè)基因集顯著富集，與SUM149相比有22個(gè)基因集顯著富集。在與炎癥相關(guān)的通路中，與MBA-MB-231、IBC3和SUM149相比，通過(guò)NF-κB的標(biāo)志性“TNFA信號(hào)”在A3250中顯著富集。A3250相比MDA-MB-231和IBC3也存在JL6 JAK STAT3信號(hào)的富集。總體，IPA和GSEA分析表明A3250中多種炎癥通路的激活。
3. A3250 IBC腫瘤引起明顯的局部和全身炎癥
病理學(xué)家對(duì)IBC中炎癥浸潤(rùn)的程度和意義有不同的看法，人們普遍認(rèn)為炎癥是癌細(xì)胞堵塞真皮淋巴管的結(jié)果。因此，研究者試圖與淋巴管浸潤(rùn)（LVI）相比，描述A3250腫瘤中炎癥細(xì)胞積累的動(dòng)力學(xué)。免疫染色顯示炎癥細(xì)胞在腫瘤侵襲皮膚淋巴管之前就已經(jīng)積累了。豐富的炎癥細(xì)胞富集可能是由于腫瘤來(lái)源的細(xì)胞因子的積極招募，而不是由于腫瘤栓塞阻塞淋巴管引起的。免疫染色進(jìn)一步顯示，在整個(gè)存活的A3250腫瘤和鄰近的真皮中，F(xiàn)4/80+巨噬細(xì)胞的密度非常高。注射后4周檢查了攜帶A3250腫瘤的小鼠的肺，H&E染色顯示肺結(jié)構(gòu)異常，其特征是密集的炎癥浸潤(rùn)和肺泡結(jié)構(gòu)缺失。流式細(xì)胞結(jié)果顯示，與無(wú)腫瘤小鼠肺相比，Ly6Chi髓系細(xì)胞有增加趨勢(shì)、血液中總CD11b+細(xì)胞、Ly6Chi炎癥單核細(xì)胞和Ly6Ghi中性粒細(xì)胞的比例顯著增加。
4. CCL2在A3250細(xì)胞和人IBC中高表達(dá)
為了確定可能介導(dǎo)A3250腫瘤髓細(xì)胞招募的原因，研究者分析了A3250腫瘤和細(xì)胞mRNA-Seq結(jié)果中趨化因子的表達(dá)。A3250腫瘤的結(jié)果分析顯示，44個(gè)趨化因子中10個(gè)有表達(dá)，其中只有3個(gè)（CCL2、CXCL5和CCL20）在腫瘤（體內(nèi)）和細(xì)胞（體外）均高表達(dá)，而CCL2的表達(dá)量最高。隨后，研究者利用Olink Target 96炎癥panel檢測(cè)了A3250細(xì)胞上清中的趨化因子，其中CCL2、CXCL5和CCL20蛋白水平較高。研究者分析了包含41個(gè)人類(lèi)IBC和55個(gè)非IBC的Van Laere芯片數(shù)據(jù)，以及包含25個(gè)IBC和57個(gè)非IBC 的Iwamoto數(shù)據(jù)。在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中，IBC的CCL2中位數(shù)表達(dá)水平均顯著高于非IBC。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，人類(lèi)IBC，如A3250，通常表現(xiàn)出較高的CCL2表達(dá)水平。
5. 趨化因子受體CCR2在A3250 IBC腫瘤模型的髓系細(xì)胞高表達(dá)
趨化因子CCL2通過(guò)CCR2發(fā)揮作用，CCR2是主要的趨化因子受體，介導(dǎo)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞招募到炎癥部位。研究者檢測(cè)了CCR2在A3250腫瘤、肺和血液的白細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，血液中存在高水平的CCR2+炎癥單核細(xì)胞和高CCR2表達(dá)的髓系細(xì)胞與A3250腫瘤和肺轉(zhuǎn)移相關(guān)。雖然CCL2在A3250細(xì)胞中高表達(dá)，但其他激活CCR2的人類(lèi)趨化因子(CCL7、CCL8、CCL13和CCL16)均未表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)表明，在A3250腫瘤模型中，CCL2作為關(guān)鍵的CCR2激動(dòng)劑，并強(qiáng)烈提示CCL2在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞招募到A3250原發(fā)和轉(zhuǎn)移位點(diǎn)中發(fā)揮重要作用。
6. CCL2敲低顯著降低了A3250腫瘤的生長(zhǎng)、肺轉(zhuǎn)移和炎癥表型
為了研究CCL2在A3250腫瘤惡性表型中的功能，研究者對(duì)CCL2進(jìn)行了shRNA敲低(KD)。CCL2敲低可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，同時(shí)IBC特征的皮膚炎癥也顯著減少。此外，CCL2敲低降低了肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生率和總體轉(zhuǎn)移負(fù)擔(dān)。大多數(shù)CCL2敲低腫瘤小鼠肺內(nèi)無(wú)大轉(zhuǎn)移，主要表現(xiàn)為彌散性腫瘤細(xì)胞，而對(duì)照組A3250腫瘤小鼠主要表現(xiàn)為大轉(zhuǎn)移。
CCL2敲低腫瘤免疫細(xì)胞的免疫染色顯示，腫瘤區(qū)域的CD45+細(xì)胞顯著減少，其中大部分是F4/80+巨噬細(xì)胞。腫瘤中CCL2的下調(diào)可減少巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和全身炎癥。
7、 人IBC存在巨噬細(xì)胞的富集
最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了基于不同免疫浸潤(rùn)的不同人類(lèi)TNBC（三陰性乳腺癌）亞型，從巨噬細(xì)胞富集到中性粒細(xì)胞富集。為了檢驗(yàn)人類(lèi)IBC是否富含巨噬細(xì)胞，研究者分析了41個(gè)人類(lèi)IBC和55個(gè)非IBC的芯片數(shù)據(jù)。分層聚類(lèi)顯示了兩類(lèi)乳腺癌，分別為富集或不富集TAM（腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞）基因。富集TAM基因的IBC樣本明顯多于未富集TAM基因的IBC樣本。免疫染色檢測(cè)巨噬細(xì)胞(CD68+)和中性粒細(xì)胞(CD66b+)顯示，高密度巨噬細(xì)胞出現(xiàn)在間質(zhì)和/或腫瘤細(xì)胞簇內(nèi)。該結(jié)果與基因表達(dá)分析表明人IBC存在巨噬細(xì)胞富集，也與研究者對(duì)A3250腫瘤的研究結(jié)果一致，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了A3250腫瘤模型與人IBC的相關(guān)性。
研究總結(jié)
本研究圍繞一個(gè)來(lái)源于三陰性炎性乳腺癌（IBC）的細(xì)胞系A(chǔ)3250進(jìn)行了研究。A3250細(xì)胞及移植瘤模型顯示了人IBC關(guān)鍵的臨床和組織病理學(xué)特征。對(duì)A3250細(xì)胞和腫瘤的轉(zhuǎn)錄組RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)了顯著的炎性特征，結(jié)合Olink Target 96炎癥panel找到了一個(gè)在A3250細(xì)胞和腫瘤中高表達(dá)的趨化因子CCL2，該趨化因子在IBC的原發(fā)和轉(zhuǎn)移位點(diǎn)發(fā)揮關(guān)鍵作用。敲低CCL2可有效改善移植瘤小鼠的疾病特征。此外，研究者發(fā)現(xiàn)，在巨噬細(xì)胞是臨床IBC中的一個(gè)主導(dǎo)亞群，這意味著耗盡或靶向巨噬細(xì)胞的免疫治療策略可能是很有前途的IBC治療方法。總體，本研究的結(jié)果表明，基于A3250細(xì)胞的IBC腫瘤模型將幫助人類(lèi)進(jìn)一步了解IBC生物學(xué)，并有助于促進(jìn)IBC靶向治療方法的開(kāi)發(fā)。
吉?jiǎng)P基因憑借多年在靶標(biāo)篩選及驗(yàn)證服務(wù)領(lǐng)域的技術(shù)積累，建立的標(biāo)準(zhǔn)化 、工程化 、系統(tǒng)化的GRP平臺(tái)，為中國(guó)研究型醫(yī)生提供科研服務(wù)，加快科研成果轉(zhuǎn)化。其中，多組學(xué)平臺(tái)包含蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)和高通量測(cè)序平臺(tái)：
·蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)擁有多臺(tái)timsTOF Pro、Exploris 480高精度質(zhì)譜儀，專業(yè)的Spectronaut Plusar、Mascot等分析軟件，提供專業(yè)的4D、DIA、TMT、PRM、磷酸化修飾組、olink蛋白質(zhì)組等檢測(cè)服務(wù)，強(qiáng)大的機(jī)器學(xué)習(xí)算法、IPA分析、蛋白基因組分析服務(wù)，系統(tǒng)的生物標(biāo)志物、分子分型、藥物靶點(diǎn)、基因功能研究等解決方案，真正讓廣大研究型醫(yī)生的科研工作更省心、更省力、更高效；
·高通量測(cè)序平臺(tái)分為常規(guī)測(cè)序服務(wù)和單細(xì)胞測(cè)序服務(wù)：單細(xì)胞測(cè)序擁有10x和BD兩個(gè)平臺(tái)，提供單細(xì)胞RNA-seq、單細(xì)胞核測(cè)序、單細(xì)胞混樣RNA-seq、單細(xì)胞TCR/BCR、單細(xì)胞（RNA+ATAC）、空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等服務(wù)；常規(guī)測(cè)序服務(wù)提供meRIP-seq（m6A/m1A/m7G/m5C 等RNA甲基化修飾測(cè)序）、acRIP-seq（ac4C RNA乙酰化修飾測(cè)序）、ATAC-seq、Ribo-seq（翻譯組測(cè)序） 、mRNA/miRNA/LncRNA/circRNA-seq、全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（兩文庫(kù)/三文庫(kù)）、外泌體miRNA/LncRNA-seq、WGS/WES、WGBS、RRBS、BSAS等服務(wù)。