在工具病毒助力腫瘤研究的話題中，CAR-T病毒占有一席之地，CAR-T全稱是嵌合抗原受體T淋巴細胞，是從患者的外周血中分離出T淋巴細胞并進行體外基因改造，大量擴增后，再回輸到患者體內，CAR-T能夠特異性識別腫瘤抗原，在腫瘤抗原的刺激下，這些輸入的CAR-T快速增殖，結合并殺滅腫瘤細胞。
但CAR-T治療也有不完美地方：造價高昂、適應癥少、細胞因子風暴以及免疫力下降導致的感染風險。臨床上急需一種高效且安全、可控的載體，擴展治療腫瘤的手段。今天我為老師們解讀一篇文獻：Leveraging gene therapy to achieve long-term continuous or controllable expression of biotherapeutics。使用腺相關病毒（AAV）來表達雙特異性抗體（CD19×CD3），從而解決了雙特異性抗體需要反復多次給藥的缺點和CAR-T療法生產流程繁瑣、需要個性化定制的缺點，實現了一次給藥，長期穩定表達治療性雙抗，可作為通用型CAR-T 療法的替代方案。此外，該研究還開發了誘導型版本，利用外顯子跳躍技術，可實現按需表達、重復表達。
基因治療的高速發展，①使替換缺失或有缺陷的基因，產生持續表達的轉基因成為前提；②單次劑量注射后，在體內實現持續和一致的血藥水平，從而解決潛在的蛋白質藥物的波峰和波谷問題；③為了增加基因治療的可控性，作者開發了TransSkip體系。那么，作者是怎么設計實驗的呢？
作者首先設計并測試了AAV8載體，啟動子選擇CAG（1.7kb），用于表達blinatumomab的氨基酸序列[1] (blinatumomab瞬時連接T細胞與靶細胞，促進T細胞活化和靶細胞凋亡,最先進的藥物，但半衰期只有2.1h)；為了保證蛋白質雙特異性抗體（CD19×CD3）高效地分泌到血液中，作者將分泌信號肽構建到外源基因的N端[2]。完成AAV的設計后，作者進行了在體實驗：將Raji-Luc/GFP淋巴瘤細胞注入免疫缺陷小鼠，同時靜脈輸注人外周血單核細胞(Figure 1F)，通過評估體內生物熒光、腫瘤大小、動物生存率、AAV的毒性，最終，作者證明單次注射AAV，B細胞持續消融，而T細胞長期保持活躍狀態，可以有效消除腫瘤。
在AAV8有效的基礎上，作者將強啟動子CAG更換為EFS（232bp），因為AAV的包裝容量限制在4.7kb以內。在罕見的宿主細胞插入事件中，較弱的啟動子也表現出較低的相鄰基因激活的基因毒性[3]。同時，作者加入了轉錄后調節元件（WPRE）這種RNA穩定元件，最大程度弱化啟動子對外源基因的表達。此外，AAV的血清型選擇rh74，因為人類中先前存在rh74抗體的患病率較低。更換了AAV的血清型和啟動子后，作者進一步評估了血清中的CD19-CD3二聚體蛋白水平，與長期表達的關系。實驗證明：在至少1年的時間里，蛋白表達水平相對穩定，動物沒有表現出與對照組動物相似的正常體重增加的毒性跡象。
作者在證明了構建的AAVrh74-scfv（CD19×CD3），是一種有效且安全的治療手段后，再次使用基因編輯的方法，構建了穩定且可控的載體-TransSkip?；谕怙@子剪切調控的原則，作者將一個有缺陷的外顯子（原癌基因KRAS）逆向構建到AAV的編碼序列中去，借助反義的Morpholino刪除該外顯子 (Morpholino（MO）全稱Morpholino Anti-sense oligos。MO屬于DNA/RNA類似物，相比核酸分子，MO分子結構特殊之處在于用嗎啉環取代了傳統核苷酸上的五碳糖環，原有的磷酸基團也發生改變，使得分子整體不帶有任何電荷，因此不需要擔心被降解，穩定性遠高于siRNA。MO通過與不同階段的mRNA結合，阻斷目標基因的表達，包括mRNA剪切階段和翻譯階段)。
TransSkip結構設計原理
（1）針對AAV，在scfv（CD19-CD3）中間插入修飾的KRAS minigene（取KRAS外顯子1及其鄰近內含子，且內部插入了多個翻譯終止信號），正常情況下，表達的scfv整體結構被KRAS minigene破壞，無法形成功能性蛋白，scfv的表達受到抑制。在外源提供針對KRAS minigene剪切位點的Morpholino，該反義核酸會導致外顯子的跳躍，即在scfv中去除KRAS外顯子，最終促進完整scfv（CD19-CD3）的表達。
（2）針對腫瘤細胞，由于大部分KRAS存在突變，且該突變會促進腫瘤細胞的發生，上述Morpholino同樣針對內源性基因的KRAS有效。Morpholino促使KRAS基因外顯子1丟失，從而破壞了KRAS的轉錄完整性，阻止了KRAS蛋白的表達，解除了KRAS原癌基因對腫瘤細胞惡化的促進作用，可謂是一石二鳥。作者鑒定了轉基因編碼序列，其中一致剪接供體序列(AAG或CAG)的外顯子部分恰好位于一致剪接受體序列(GG或GT)的外顯子部分附近，因此插入在那里，當剪接出來時，將產生原始序列。作者將KM序列插入到潛在剪接供體/受體序列的5'位點中，以便在翻譯過程中盡早破壞編碼序列。
作者連續兩天(第16周和第36周)給CD19 TransSkip治療小鼠靜脈注射單劑量的KTS Morpholino (Vivo-KTS)或兩次靜脈注射劑量的KTS Morpholino；在這些時間點，作者給另一組CD19 TransSkip處理的小鼠注射倒置Morpholino (Vivo-KTS invert)作為對照。正如預期的那樣，在整個實驗過程中，作者觀察到CD19 TransJoin處理小鼠血清中CD19-CD的穩健表達，而在給予Vivo-KTS invert的CD19 TransSkip處理小鼠血清中沒有檢測到CD19-CD3的濃度(Figure 5D)。相比之下，給予Vivo-KTS的小鼠在給藥后1天內產生CD19-CD3二聚體，然后在2-3周內慢慢消退到未誘導的水平。在近一年的時間里，作者每次給Vivo-KTS都能重新誘導表達。這些數據在體內證明了使用外顯子跳躍來間斷和重復激活AAV結構的治療性蛋白表達的原理。作者還在5周內給予重復劑量的Vivo-KTS，證明作者可以在更長的時間內實現持續表達。
結 語
AAV作為基因治療的載體，已經被FDA批準用于罕見的單基因疾病，像血友病和肌肉萎縮癥[4]。如果臨床上需要一種基因治療的載體，同時滿足安全、長效、可控，那么AAV是首選的工具病毒。本文中，僅需要單次注射TransSkip，在morpholino的誘導下，可控的、持續表達CD19-CD3二聚體，至少一年。腫瘤治療的源頭是免疫學，免疫學的研究手段是基因編輯，基因編輯技術為腫瘤治療提供了新的手段，期待早日完成臨床轉化，造福患者。
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【參考文獻】
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of a bispecific tandem diabody. Protein Eng. Des. Sel. 17, 357–366 (2004).
2. G. Guler-Gane, S. Kidd, S. Sridharan, T. J. Vaughan, T. C. Wilkinson, N. J. Tigue, Overcoming the refractory expression of secreted recombinant proteins in mammalian cells through modification of the signal peptide and adjacent amino acids. PLOS ONE 11, e0155340 (2016).
3. U. P. Dave, K. Cornetta, AAV joins the rank of genotoxic vectors. Mol. Ther. 29, 418–419 (2021).
4. J. R. Mendell, S. A. Al-Zaidy, L. R. Rodino-Klapac, K. Goodspeed, S. J. Gray, C. N. Kay,S. L. Boye, S. E. Boye, L. A. George, S. Salabarria, M. Corti, B. J. Byrne, J. P. Tremblay, Current clinical applications of in vivo gene therapy with AAVs. Mol. Ther. 29, 464–488 (2021).