一個基因的表達(dá)受多種表達(dá)元件調(diào)控，有啟動子，增強(qiáng)子/沉默子，5’UTR，3’UTR，轉(zhuǎn)錄因子，microRNA等，當(dāng)我們需要驗(yàn)證其具體功能，如啟動子的活性，5’UTR和3’UTR是否影響基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子對啟動子是激活還是抑制，microRNA在靶基因3UTR上的結(jié)合位點(diǎn)，一段特定序列是否有增強(qiáng)子/沉默子功能時，螢火蟲熒光素酶報告基因就是很好的一個用來驗(yàn)證功能的工具。
今天就以pGL3 promoter和pGL3 Basic兩個載體來簡單說明如何驗(yàn)證這些表達(dá)元件的功能，這兩個載體都帶有螢火蟲熒光素酶報告基因，區(qū)別是pGL3 promoter在螢火蟲熒光素酶報告基因上游有SV40啟動子，而pGL3 Basic則只有螢火蟲熒光素酶報告基因。請大家一定要注意待研究元件相對于螢火蟲熒光素酶基因的位置，位置不同，功能不同。
1、 啟動子轉(zhuǎn)錄活性/轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)驗(yàn)證
啟動子轉(zhuǎn)錄活性對于一個基因表達(dá)至關(guān)重要，通常做法是：預(yù)測啟動子序列，默認(rèn)取轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000bp作為可能的啟動子，將預(yù)測得到的序列構(gòu)建到pGL3 Basic載體螢火蟲熒光素酶報告基因的上游，通過報告基因判斷啟動子活性。與啟動子形影不離的就是轉(zhuǎn)錄因子的，轉(zhuǎn)錄因子對于基因的表達(dá)也很關(guān)鍵。我們獲得啟動子序列后，需要通過專門的軟件來預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子在啟動子區(qū)上的結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)consensus sequence序列進(jìn)行突變設(shè)計，然后通過于突變?nèi)笔ЫM對比，判斷轉(zhuǎn)錄因子的功能以及在啟動子上的結(jié)合位點(diǎn)。
2、 microRNA結(jié)合位點(diǎn)驗(yàn)證
對于編碼基因而言，通常認(rèn)為microRNA是通過結(jié)合到編碼基因的3‘UTR來發(fā)揮作用。具體做法是：使用專門的網(wǎng)站比如targetscan進(jìn)行編碼基因于3’UTR結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測，獲得可能的結(jié)合位點(diǎn)后，結(jié)合位點(diǎn)上下游延伸100bp左右的序列，將序列構(gòu)建到pGL3 promoter載體螢火蟲熒光素酶報告基因下游。根據(jù)螢火蟲熒光素酶報告基因判斷microRNA是否對編碼基因有調(diào)控作用。一般做法：同時構(gòu)建結(jié)合位點(diǎn)相應(yīng)的突變型序列質(zhì)粒，野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒做對比。
3、 5’UTR和3’UTR功能驗(yàn)證
對于一個編碼基因，通常都會有5’UTR和3‘UTR，有些編碼基因他們的5’UTR和（或）3‘UTR可能會對基因的表達(dá)有影響。5’UTR具體做法是：將編碼基因的5’UTR構(gòu)建到pGL3 promoter載體螢火蟲熒光素酶報告基因的上游，SV40啟動子下游，通過這種結(jié)構(gòu)來判斷5UTR’對基因表達(dá)的影響。而對于3’UTR具體做法是：將編碼基因的3’UTR構(gòu)建到
或者3’UTR構(gòu)建到pGL3 promoter載體螢火蟲熒光素酶報告基因的下游，通過這種結(jié)構(gòu)來預(yù)測3’UTR的功能，這里的3’UTR通常都是全長。提供一篇文獻(xiàn)Med Sci (Basel). 2017 Dec 22;6(1). pii: E2.The ODC 3'-Untranslated
Region and 5'-Untranslated Region Contain cis-Regulatory Elements: Implications
for Carcinogenesis參考。
4、 增強(qiáng)子/沉默子功能驗(yàn)證
增強(qiáng)子/沉默子功能驗(yàn)證的通常做法是：將增強(qiáng)子/沉默子構(gòu)建到pGL3 promoter載體SV40啟動子的上游，如果確實(shí)有增強(qiáng)子或者沉默子功能，那就會影響SV40啟動子的活性，通過這種結(jié)構(gòu)來驗(yàn)證功能。
5、 效應(yīng)元件(response element)功能驗(yàn)證
轉(zhuǎn)錄因子效應(yīng)元件的序列通常都是很短的一段堿基序列，比如p53效應(yīng)元件，NFkB效應(yīng)元件。通常做法是：構(gòu)建這段序列的多個重復(fù)，然后后面接一個miniCMV（minimal CMV (miniCMV) promoter is a
low expression synthetic promoter in mammalian cells），然后構(gòu)建到pGL3 Basic載體螢火蟲熒光素酶報告基因的上游進(jìn)行功能驗(yàn)證。
那螢火蟲熒光素酶報告基因還有其他用法嗎？答案肯定是：當(dāng)然有！！這些我認(rèn)為是比較高大上一些，舉例：
1、 螢火蟲熒光素酶報告基因做示蹤標(biāo)記干細(xì)胞，將目的基因與螢火蟲熒光素酶基因融合融合表達(dá)，做成轉(zhuǎn)基因小鼠，進(jìn)行干細(xì)胞移植。
2、 用螢火蟲熒光素酶報告基因做活體成像來做藥效學(xué)評價，特別是在抗腫瘤新藥研究中應(yīng)用較多。
3、 類似于熒光蛋白，將熒光素酶基因的C端和N端分別連在兩個不同的蛋白質(zhì)上，若兩個蛋白質(zhì)相互作用，則用成像技術(shù)研究活體動物體內(nèi)他們的相互作用。