研究基因功能的常見方法就是減少或抑制基因的表達，然后進行表型分析。基因沉默主要發生在轉錄前和轉錄后兩種水平，轉錄前水平是由于DNA修飾或染色體異染色質化等引起基因不能正常轉錄，而轉錄后水平則是通過降解RNA沉默基因的表達。

下面簡單介紹幾種常見的基因沉默技術，大家可以根據實驗需求選擇合適的方式進行研究。

一、RNAi

RNAi是最常用的基因沉默技術，由雙鏈dsRNA介導對同源RNA進行降解。dsRNA經核酸內切酶Dicer切割形成約21~23bp siRNA，RNA解旋酶將siRNA雙鏈解開，反義鏈與RNA誘導沉默復合物RISC形成復合物，最終由siRNA互補結合靶RNA引導核酸酶切割，實現轉錄后水平的基因沉默。

如果想要短期內實現基因的下調，可以通過化學合成siRNA轉染細胞進行實驗，但合成的siRNA易被降解，目前主要通過構建表達載體轉錄得到siRNA。三型啟動子常用于表達shRNA，但U6和H1沒有細胞特異性，為了滿足動物體內特定細胞的基因沉默，采用與shRNA形成過程類似的miRNA骨架設計shRNA，利用二型啟動子實現靶基因的特異性下調（詳見miRNA骨架設計shRNA）

shRNA和miRNA形成圖示

RNAi技術最令人困擾的就是脫靶問題，原本需要完全互補19~23bp RNA才能發生的基因沉默，只要通過miRNA途徑僅需11~15bp堿基互補就能產生干擾效果，而且如果脫靶基因與目的基因功能相似，即使這個shRNA產生了干擾作用，也不會達到預期程度的表型，所以需要同步做干擾回復實驗來證明siRNA的作用，避免脫靶效應。

二、CRISPR/Cas9

Cas9在基因編輯領域深受關注，起初它是細菌應對病毒感染或外源質粒入侵的防御系統，后來逐漸用于基因敲除。Cas9系統中的crRNA和tracrRNA嵌合形成sgRNA，引導cas9切割基因組DNA，隨后通過修復完成基因編輯。對于編碼基因來說，主要通過NHEJ修復方式敲除目的基因（非編碼lncRNA的敲除詳見）

Cas9系統衍生的CRISPRi技術經常用于下調基因的表達，該系統dCas9蛋白喪失了酶切活性不能切割基因組DNA，dCas9結合在啟動子區產生的空間位阻抑制了基因的內源轉錄，下調了基因的表達。另外，將dCas9與轉錄阻遏結構域（KRAB）融合則會限制DNA的伸展，提高基因的沉默效率。在動物實驗中，常用特異性啟動子表達dCas9，通過CRISPRi實現特定細胞內的基因沉默。

利用CRISPRi技術抑制不同神經元Syt1基因的表達¹

三、Cas13

除了Cas9用于調控基因表達外，張鋒實驗室首次發現Cas13a能夠靶向切割RNA，后來Cas13家族其他蛋白如Cas13b、Cas13c和Cas13d也被相繼報道具有沉默RNA的作用。與Cas9相比，Cas13蛋白不會切割基因組DNA，僅會靶向并沉默RNA，作用具有可逆性，因此，Cas13被廣泛用于后天性疾病和RNA病毒感染治療中。

目前Cas13家族應用最多的是Cas13d CasRx蛋白，CasRx對RNA的切割活性高，并且蛋白分子量小，易被裝在aav載體中和sgRNA同步遞送到體內，實現動物體內的基因沉默2，Cas13技術為治療后天代謝性疾病提供了很大的可能。

CasRx介導肝臟內Pcsk9的表達沉默²

Cas13被證實在哺乳動物細胞中具有抗腦膜炎和水皰性口炎病毒的能力³，這為RNA病毒的治療提供了理論依據。但是RNA病毒在傳播過程中會不斷變異，RNA序列不斷發生變化，靶向RNA病毒的治療藥物可能存在失效的風險。近兩年爆發的新冠病毒已經產生了很多突變體，Cas13能否用于新冠的治療還需要更多實驗數據支持。

以上列舉了幾種常用的基因下調技術，雖各有特色，但作用方式卻有相似之處。吉凱基因可以提供以上技術的工具載體，幫助老師實現體內外細胞的基因沉默，快來咨詢訂購吧！

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