一、實驗原理
凝膠遷移或電泳遷移率實驗 (electrophoretic mobility shift assay，EMSA)是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析(Hellman LM and Fried MG, 2007)。這一技術(shù)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白，目前也可用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用 (Rio, 2018)。
在實驗中，通常將純化的蛋白或細胞粗提液和生物素標記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。其中DNA-復(fù)合物或RNA-復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動得慢，而探針移動的較快。
圖1 EMSA原理圖
二、實驗?zāi)康?/span>
對探針和蛋白進行互做驗證
三、主要儀器
DYCP-32A核酸電泳儀
GNP-9080型恒溫培養(yǎng)箱
GL-21M型高速冷凍離心機
DK-42恒溫水浴鍋
Forma3111型細胞培養(yǎng)箱
JY92-IIN型細胞超聲破碎儀
ZQWY-200型恒溫振蕩器
四、實驗步驟
樣本制備
探針標記及檢測
形成蛋白-探針復(fù)合物
制備凝膠、電泳
轉(zhuǎn)膜
檢測
五、課后習題及解答
1.研究蛋白-核酸互作有哪些技術(shù)？
答：凝膠電泳遷移率（EMSA）、染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）、RNA Pull Down / DNA Pull Down、雙熒光素酶報告基因、酵母單雜交。
2、為什么實驗背景高？
答：1）TBE溶液中有懸浮物；2）曝光或者成像時間過長；3）蛋白的質(zhì)量不高，雜質(zhì)多；4）沒有清洗干凈；5）實驗過程中膜沒有一直處于濕潤狀態(tài)；6）封閉時間不足或者效率不高。
3、探針的存儲條件？
答：為防止探針降解，探針應(yīng)保存在 -20 ℃。
4、為什么看不到遷移帶？
答：1）蛋白降解或者提取量不足；2）標記的DNA探針量太少或者樣本中沒有可以與探針結(jié)合的蛋白；3）探針降解或者探針與蛋白無特異性互作；4）曝光或成像時間過短；5）轉(zhuǎn)膜效率低或者未轉(zhuǎn)過來。
5. Western Blot和EMSA有什么不同的意義
答：Western Blot 只能反應(yīng)含量，不能反應(yīng)待測分子的生物學活性。EMSA是蛋白分子與靶序列核酸的結(jié)合量，反應(yīng)的是該分子的生物學活性。
6.在DNA探針的選擇上，要考慮哪些重要因素？
答：1）目的DNA的長度應(yīng)小于300bp；2） 如目的蛋白已被鑒定，應(yīng)該使用短的寡核苷酸片段；3）長的限制性酶切片段可用于對特定的啟動子/增強子區(qū)域內(nèi)的蛋白結(jié)合位點定位 。
六、考試重點
1.金開瑞EMSA技術(shù)金開瑞EMSA技術(shù)
金開瑞提供EMSA檢測技術(shù)服務(wù)，幫助您檢測DNA結(jié)合蛋白、RNA結(jié)合蛋白、特定的蛋白質(zhì)，并可進行未知蛋白的鑒定。
2技術(shù)流程技術(shù)流程
接收訂單及樣品 、實驗設(shè)計、合成探針、EMSA電泳凝膠配置、EMSA反應(yīng)、電泳檢測、顯色反應(yīng) 、結(jié)果交付
3客戶提供
1.需提取核蛋白的細胞＞107，動物組織不少于400 mg，植物組織不少于2 g，建議客戶在金開瑞表達重組蛋白；
2.探針序列；如使用結(jié)合蛋白特異性抗體，抗體50 μL以上，濃度大于0.5 mg/mL。
4 最終交付
實驗報告，含完整的實驗流程、實驗結(jié)果數(shù)據(jù)及圖片。
七、課外延伸
八、參考文獻
Hellman LM and Fried MG, 2007. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols, 2(8):1849-61.
Rio DC, 2018. Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes.Cold Spring Harb Protoc, (4):435-40.