確保外源基因在細胞或者動物體內(nèi)，持續(xù)和高水平的表達具有廣泛的應用需求及科研價值。當前遞送外源基因的生物學手段，主要是運用質(zhì)粒或者病毒作為媒介表達基因，而啟動子是實現(xiàn)基因表達的基礎元件。但是，經(jīng)常有老師反饋，為什么基因表達不強呢？為什么細胞傳代幾次之后就不表達了呢？今天，小編帶您盤點下，常用的組成型啟動子表達效率與細胞的關(guān)系。
啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因上游的一段可以行使轉(zhuǎn)錄起始功能的序列，結(jié)構(gòu)如下：
根據(jù)其對α-鵝膏蕈堿的敏感性不同，分為三類，常用的啟動子是Ⅱ、Ⅲ兩種啟動子。其中，Ⅲ型啟動子主要表達非編碼的短序列RNA，比如shRNA、miRNA等，我們常說的啟動子，或者細胞里面常規(guī)基因的啟動子，幾乎都是Ⅱ型啟動子，其特點是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度不限，編碼與否不限等特點。
酶的種類1 | 存在 | 功能 | 對抑制物的敏感性 |
RNA聚合酶I | 核仁 | 合成rRNA前體 | 不敏感 |
RNA聚合酶II | 核質(zhì) | 合成mRNA前體及大多數(shù)snRNA | 敏感 |
RNA聚合酶III | 核質(zhì) | 合成5S rRNA前體、tRNA前體及其他的核和胞質(zhì)小RNA前體 | 存在物種特異性 |
Ⅱ型啟動子在使用特點上又可分為三大類：組成型啟動子、特異性啟動子、誘導啟動子。特異性啟動子只能在特定細胞表達，因此適合動物實驗使用；誘導啟動子需要加入特定的藥物才能激發(fā)或者抑制其活性，如四環(huán)素誘導TRE表達；而表達系統(tǒng)中，運用最多的則是組成型啟動子，這類啟動子在絕大部分細胞里面都能維持一定的表達活性，當然，不同的啟動子也有高低表達之分。
載體上最常見的組成型啟動子包含：β-肌動蛋白啟動子（ACTB），巨細胞病毒（CMV），延伸因子-1α（EF1α），磷酸甘油酸激酶（PGK）、泛素C（UbC、本文別名FCIV），具有CMV最大內(nèi)含子的CMV啟動子/增強子（CMVi啟動子）、巨細胞病毒增強子和雞β-肌動蛋白啟動子組成的CAG，猿猴病毒來源的SV40等。其中，最常見的是CMV啟動子，在大量的商業(yè)化載體上如pcDNA3、pEGFP使用，病毒上最常見啟動子是CMV、EF1α，說明這些都是高表達啟動子，那么所有細胞系都合適嗎？小編收羅了不同文獻、不同細胞類型的驗證實驗，接著往下看：
混合細胞系
作者選了多種來源的細胞，包含成纖維細胞、腫瘤細胞、干細胞、高度分化的肌肉細胞等，使用六個哺乳動物組成型啟動子，每個都插入GFP包裝成慢病毒轉(zhuǎn)導細胞，通過流式細胞儀對GFP強度進行定量：
小鼠尾巴成纖維細胞（129TF），小鼠胚胎成纖維細胞（MEF），小鼠成肌細胞（C2C12），大鼠間充質(zhì)干細胞（MSC），人成纖維細胞（MRC5），人纖維肉瘤細胞（HT1080），人胚胎腎細胞（293T）和恒河猴獼猴乳腺腫瘤細胞（CMMT）
結(jié)果表明：UBC跟PGK始終是弱的，SV40相對較強，EF1A和CAG啟動子在所有細胞類型中均具有較強的一致性，CMV啟動子是最多變的，是在一些細胞類型（很強烈例如，293T和CMMT）和其他（較弱例如，MRC5和MSC）。
由此看出，CMV在腫瘤細胞系傾向高表達，而EF1A和CAG在大部分細胞表達趨于穩(wěn)定，且這三個高強度啟動子在干細胞等類型活性都有所下降。所以，針對常規(guī)的腫瘤細胞系，常規(guī)體細胞系，三個啟動子的效果還是不錯的，但由干細胞表達效果差，推導出非常規(guī)的細胞系，如懸浮細胞系、神經(jīng)細胞等，啟動子如何選擇呢？
胚胎干細胞（hESCs）
干細胞相對復雜，因為還存在分化過程的干細胞，那么干細胞對于啟動子的選擇有何特點呢？
對hESCs中ACTB，CMV，EF1α，PGK和UbC啟動子的活性進行了比較研究。選擇慢病毒介導的基因轉(zhuǎn)移作為基因傳遞系統(tǒng)，通過FACS分選出了eGFP +細胞,結(jié)果如下：
1.未分化的hESCs的啟動子活性
在FACS分選后的15、30和50天測量啟動子活性，通過OCT3 / 4，NANOG和hES-Cellect（Cellartis AB）多能蛋白的標記證實了eGFP +細胞的多能性：
第0天，所有啟動子的eGFP+百分比約為98％，第30天，ACTB，EF1α和PGK的啟動子活性均相等，第50天，CMV-eGFP+細胞的百分比降低于10％，EF1α也出現(xiàn)下降。
2. 分化的hESCs中的啟動子活性
慢病毒介導GFP的將hESC系SA121，在第0天（d0），未分化狀態(tài)第22天（undiff），分化為胚狀體22天（EB），測試GFP +細胞的比例，結(jié)果顯示，啟動子在分化過程中被顯著下調(diào)，并且在大約50％的分化細胞中沒有活性。EF1α是分化過程中最穩(wěn)定的啟動子；CMV啟動子僅在細胞的一小部分（約15％）具有活性。
總之，就長期保持未分化的hESCs的轉(zhuǎn)基因（eGFP）表達而言，ACTB，EF1α和PGK啟動子是最穩(wěn)定的啟動子；而在分化過程中，成型啟動子的活性會下降，相對而言，EF1α啟動子具有最高的穩(wěn)定性。原因即細胞在分化過程中，所表達的轉(zhuǎn)錄因子是有差異的，部分啟動子表達所需的轉(zhuǎn)錄因子丟失，同時染色體結(jié)構(gòu)的改變影響了外源插入序列的狀態(tài)，導致啟動子出現(xiàn)沉默現(xiàn)象。
造血干細胞（HSC）/祖細胞
造血干細胞（HSC）具有自我更新和多譜系分化成所有成熟血細胞的潛力。因此，有效轉(zhuǎn)導至HSCs將提供治療因血細胞功能異常而導致的多種疾病的機會，并且將成為研究HSCs增殖，分化和運輸調(diào)節(jié)的有力工具。作者構(gòu)建了攜帶多個啟動子表達熒光的腺病毒，感染兩種狀態(tài)的造血細胞，以流式檢測：
成熟CD34+ 成熟CD34+
免疫細胞
結(jié)果顯示：當用于造血細胞中時，CMV啟動子傾向于沉默。轉(zhuǎn)基因可能以非常低的水平表達或無法檢測。EF1α、CMVi和CAG啟動子在轉(zhuǎn)導人骨髓CD34+細胞方面表現(xiàn)優(yōu)異。特別地，CAG啟動子在CD34+細胞和未成熟的CD34+亞群中最有效地發(fā)揮作用。
當前，以CAR-T和TCR-T為代表的細胞治療非常火熱，前者都需要運用慢病毒感染T細胞。免疫類細胞，諸如T細胞，病毒感染難度較大，啟動子的選擇得注意。
作者構(gòu)建多個啟動子的慢病毒載體表達熒光，感染經(jīng)過IL-2刺激過的PBL細胞，以FACS檢測，觀察到CMV啟動子在原代T細胞驅(qū)動效率低，CAG也相對較差，其余幾個啟動子的效率相近，都在60%上下。
進一步以以抗CD3抗體OKT3刺激細胞，再進行實驗，活化后的T細胞，多個啟動子的表達效率得到增強，其中以MSCV啟動子最優(yōu)。
在PBL中，發(fā)現(xiàn)含有MSCV啟動子的載體最適合，在最低程度刺激的淋巴細胞和高度活化的淋巴細胞中的表達。當然，文章沒有比較EF1α，實際后者在T細胞也有不俗的表達水平。
神經(jīng)細胞
用CMV-GFP，PGK-GFP，MND-GFP和泛素C啟動子（FCIV）轉(zhuǎn)導了含有神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的小鼠新皮層培養(yǎng)物。轉(zhuǎn)導后四天，我們對神經(jīng)元（NeuN陽性）進行檢測，在FCIV轉(zhuǎn)導的培養(yǎng)物中85％的神經(jīng)元表達了GFP，PGK為55.2％，且大多數(shù)報告基因陽性細胞與NeuN共定位；而CMV為4.1％、MND為0.7％。且?guī)缀跖cNeuN染色的細胞不重疊，說明后兩者不適合神經(jīng)元的表達。
以上述病毒轉(zhuǎn)導來自SH-SY5Y神經(jīng)母細胞瘤細胞系，結(jié)果顯示：CMV，PGK和FCIV在未分化和分化的神經(jīng)母細胞瘤細胞中均具有活性，但CMV啟動子活性最高，尤其是在分化后（小腦顆粒神經(jīng)元顯示出相同的結(jié)果，數(shù)據(jù)見原文）。
對于涉及原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)的研究，UBC和PGK啟動子可能是基因表達的最佳選擇。UBC，PGK，CMV和MND啟動子均適用于轉(zhuǎn)導原代星形膠質(zhì)細胞。在小腦顆粒細胞和分化的SH-SY5Y神經(jīng)母細胞瘤培養(yǎng)物中，CMV啟動子指導最穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因表達。
總結(jié)
通過本文一系列細胞及使用啟動子的使用情況的整理，我們可以得出如下結(jié)論：
1.CMV啟動子作為最為廣泛使用的啟動子，適合在腫瘤細胞、肌肉、肝臟等體細胞或者貼壁細胞的表達，而不適合大多數(shù)干細胞、懸浮細胞及原代細胞的表達；
2.EF1α啟動子適合干細胞、原代細胞、造血細胞等的表達，在常用細胞如HEK293、腫瘤等細胞系中弱與CMV；
3.部分細胞在傳代過程中，外源啟動子會出現(xiàn)沉默現(xiàn)象，不同的啟動子沉默效率有所差異，對于少見的細胞系，或者會分化的細胞系，研究者需要考慮啟動子的選擇，或者多做些分組；
4.CAG啟動子在不少細胞系，諸如免疫細胞、體細胞，有不次于CMV的表達效率，也是基因表達的一個較優(yōu)選擇的啟動子。
實際上，常用于表達外源基因的啟動子主語局限于CMV、EF1α、CAG、UBC等，本文涉及的PGK、SV40等主要用于表達熒光、抗性等，很多載體出現(xiàn)熒光弱等問題，可以看看表達熒光用的何種啟動子。當然，諸如懸浮細胞還可以使用SFFV等啟動子實現(xiàn)高表達（可參考吉凱基因懸浮病毒載體使用手冊）。總之，啟動子的選擇對于基因的表達至關(guān)重要，吉凱也開發(fā)了更加高效表達的啟動子系列，對于基因表達弱，熒光弱的老師們，快來吉凱咨詢吧！！！
【參考文獻】
1.Systematic Comparison of Constitutive Promoters and the Doxycycline-Inducible Promoter
2.Quantitative Comparison of Constitutive Promoters in Human ES cells
3.Optimization of adenovirus serotype 35 vectors for efficient transduction in human hematopoietic progenitors: comparison of promoter activities
4.Optimal promoter usage for lentiviral vector-mediated transduction of cultured central nervous system cells
5.Lentiviral Vector Design for Optimal T Cell Receptor Gene Expression in the Transduction of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor-Infiltrating Lymphocytes