口腔鱗狀細胞癌 (OSCC) 是最常見的口腔惡性腫瘤，轉移是導致 OSCC 預后不良的原因。自噬被認為通過緩解各種細胞壓力來促進 OSCC 的發展。然而，自噬在 OSCC 細胞增殖和轉移中的機制尚不清楚。
近日，上海交通大學、浙江大學和陸軍軍醫大學的研究團隊合作在Signal Transduction and Targeted Therapy（中科院JCR一區，IF：18.187 ）上發表了題為“NUPR1 promotes the proliferation and metastasis of oral squamous cell carcinoma cells by activating TFE3-dependent autophagy”的研究論文。研究者通過對福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）腫瘤樣本的蛋白質組進行檢測，發現了一個在淋巴結轉移組中顯著上調的蛋白——NUPR1，并通過實驗明確NUPR1-TFE3軸通過自噬途徑促進 OSCC 細胞增殖和體內外轉移的機制。本研究可能為 OSCC 的治療提供潛在的治療靶點。
研究思路
1. FFPE蛋白質組學發現NUPR1在有淋巴結轉移的OSCC中顯著上調
作者對10個有淋巴結轉移（LNM）和10個無淋巴結轉移的口腔鱗狀上皮細胞癌組織FFPE樣本進行了蛋白質組學檢測，共定量了3021個蛋白。有淋巴結轉移比無淋巴結轉移分析得到208個上調蛋白和165個下調蛋白。其中NUPR1蛋白在有淋巴結轉移組中的表達顯著高于無淋巴結轉移組，是上調倍數前五的蛋白。
2. NUPR1與患者的OSCC進展和不良預后呈正相關
研究者使用免疫組化染色（IHC）進行了NUPR1的組織芯片（TMA）實驗（OSCC組織88個，正常口腔黏膜組織20個）。結果顯示，NUPR1在OSCC組織中顯著高表達。臨床相關性分析顯示，高表達NUPR1與OSCC TNM分期和淋巴結轉移正相關。KM分析表明，高表達NUPR1的患者有更低的總生存率，即高表達NUPR1意味著不良的預后。
3. NUPR1基因敲低(KD)抑制了OSCC的進展
為了明確NUPR1在OSCC進展中的作用，作者在高表達NUPR1的Cal27和HN6 癌細胞系中對NUPR1進行敲低（NUPR1 KD）。集落形成實驗顯示，NUPR1 KD顯著降低了癌細胞的集落形成效率。此外，傷口愈合和Transwell檢測顯示，NUPR1 KD 的OSCC細胞遷移和侵襲能力明顯受到抑制?？傮w而言，NUPR1 敲低有效地抑制了OSCC的進展。
4. 蛋白質組學揭示自噬在NUPR1介導的OSCC進展過程中起著關鍵作用
為了闡明NUPR1在OSCC進展中的潛在機制，研究者通過TMT定量蛋白質組學檢測了NUPR1敲低的Cal27細胞和對照細胞之間的蛋白譜變化（3vs.3）。與對照組相比，NUPR1敲低的OSCC組中27個蛋白顯著上調，28個蛋白顯著下調。KEGG富集顯示，NUPR1敲低組的自噬通路顯著富集。該結果表明，自噬可能在NUPR1介導的OSCC進展中發揮重要作用。
5. NUPR1 敲低阻斷了OSCC細胞中的自噬流
接下來，研究者進一步探索了NUPR1敲低是否影響OSCC細胞的自噬流（autophagic flux）。MAP1LC3B-I是一個公認的自噬標記，通常駐留在細胞質，但在誘導自噬時，它會被脂化并嵌入自噬體膜(形成MAP1LC3B-II 異構體)。免疫印跡分析顯示NUPR1敲低增加MAP1LC3B-II的蛋白表達水平。此外，在Cal27和HN6細胞中也檢測到SQSTM1的明顯升高。自噬涉及多個步驟，自噬小體的積累可能是由于自噬活性上調或自噬小體周轉減少所致。NUPR1敲低導致MAP1LC3B-II和SQSTM1的表達增加，這似乎意味著NUPR1 敲低損害了OSCC細胞的自噬流。氯喹(CQ)抑制溶酶體活性，干擾自噬體和溶酶體之間的融合，抑制自噬。然而，NUPR1敲低誘導的MAP1LC3B-II表達的增加不受CQ共處理的影響。這些結果表明，NUPR1敲低抑制了OSCC細胞的自噬流。
由于自噬是一個動態的再循環系統，具有多步驟的過程，研究者進一步研究了NUPR1敲低在早期或晚期誘導的自噬抑制作用。最終結果表明，NUPR1 敲低并不能影響OSCC細胞中自噬小體的形成或成熟。
7. NUPR1敲低對OSCC細胞中的自噬體-溶酶體融合無影響
自噬小體與溶酶體的融合是自噬降解的一個基本過程。研究者通過實驗發現，在Cal27和HN6細胞中，自噬體標記物GFP-LC3和溶酶體標記物LAMP2之間的共定位比例不受NUPR1敲低的影響。
8. NUPR1敲低抑制了OSCC細胞中溶酶體的功能
為了研究NUPR1敲低是否抑制溶酶體功能，研究者檢測了位于溶酶體膜表面的溶酶體標記物LAMP1和LAMP2的表達水平。結果表明，NUPR1敲低抑制了Cal27和HN6細胞中LAMP1的表達，但沒有抑制LAMP2的表達。在NUPR1敲低的OSCC細胞中，溶酶體蛋白水解活性明顯被抑制。因此，NUPR1敲低對自噬流的損害可能是通過抑制OSCC細胞中的溶酶體功能來介導的。
9. TFE3負責OSCC細胞中NUPR1介導的自噬溶酶體過程
為了闡明NUPR1介導的自噬-溶酶體加工的潛在機制，研究者分析了NUPR1敲低的Cal27細胞與對照細胞之間的差異蛋白。NUPR1敲低OSCC細胞中，TFE3顯著下調。研究者同時用PCR證實了自噬流中涉及的“TFE3應答基因”的表達變化，提示NUPR1在自噬溶酶體事件中發揮了關鍵作用，并可能與TFE3有關。
最近，NUPR1被報道為調控基因轉錄的重要轉錄因子。因此，研究者采用熒光素酶報告基因實驗來檢測NUPR1和TFE3之間的關系。結果表明，在自噬激動劑雷帕霉素(0.1μM)處理24h的OSCC細胞中，TFE3啟動子活性明顯增加，但與對照組相比，在NUPR1敲低的OSCC細胞中明顯被抑制。綜上所述，在OSCC進展過程中，NUPR1通過增加TFE3啟動子活性和激活TFE3轉錄來維持自噬流。此外，研究者在OSCC組織中檢測了TFE3，發現NUPR1與TFE3的表達呈正相關。過表達TFE3可以顯著挽救NUPR1敲低對Cal27和HN6細胞溶酶體功能的損傷。此外，在NUPR1缺失的OSCC細胞中，TFE3過表達也顯著降低了MAP1LC3B-II和SQSTM1的積累。
10. NUPR1通過激活TFE3依賴的自噬促進OSCC的進展
最后，研究者對TFE3進行過表達，觀察NUPR1敲低OSCC細胞進展能力的變化。結果表明，TFE3過表達部分逆轉了NUPR1敲低介導的OSCC細胞遷移和侵襲的抑制作用。
此外，研究者還發現NUPR1敲低導致接種于裸鼠皮下的Cal27細胞形成的腫瘤的體積和重量明顯減少。NUPR1敲低也抑制了轉移性結節的形成和生長。同時，NUPR1敲低有效地抑制了異種移植瘤模型中TFE3和“TFE3應答基因”的表達。在對轉移性結節的評估中也得到了同樣的結果。總之，這些發現表明，NUPR1敲低對OSCC進展的抑制依賴于TFE3活性的抑制。
研究者對有淋巴結轉移和無淋巴結轉移的口腔鱗狀細胞癌 (OSCC)組織FFPE樣本進行了基于質譜的蛋白質組學檢測。NUPR1被確定為在有淋巴結轉移的患者中顯著高表達的關鍵蛋白，并與OSCC轉移和不良預后呈正相關。NUPR1敲低能顯著OSCC細胞系的增殖和轉移。后續機制實驗進一步確定NUPR1敲低誘導癌細胞自噬流損傷，且是通過影響溶酶體功能障礙而非其他關鍵的自噬步驟。最后，研究者進一步確認，在OSCC進展過程中，NUPR1通過增加TFE3啟動子活性和激活TFE3轉錄來維持自噬流。因此，本研究拓寬了關于NUPR1-TFE3依賴的自噬在OSCC進展中的潛在治療靶點的新見解。
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