基本信息
題目：Digestion-ligation-only Hi-C is an efficientand cost-effective method for chromosome
conformation capture
期刊：Nature Genetics
影響因子：31.694
主要技術：DLO Hi-C、原位DLO Hi-C、HCR、高通量測序、生信分析
研究背景
基因組的三維結構對DNA的復制、損傷修復及轉錄調控起著至關重要的作用。通過探索染色質間的遠程調控作用，可以鑒定得到調控元件的未知靶基因。
雖然Hi-C有助于揭示基因組的三維結構，但是有一些因素限制了它的擴大應用，比如復雜繁瑣的實驗流程、隨機自連的DNA片段帶來的高噪聲以及缺乏簡單明確的噪聲評估方法。Hi-C后來也衍生出了一些改進技術，比如TCC、原位Hi-C、micro-C、RTCC、DNase Hi-C、targeted DNase Hi-C以及capture Hi-C。雖然這些先進的方法推動了染色體構象捕獲技術的發展，但是從提高信噪比、簡化實驗流程，同時降低實驗和測序成本來講，我們仍然任重道遠。
在本研究中，作者找到了一種方法，這種方法通過簡單的酶切酶連步驟，取代了之前的生物素標記然后拉取DNA片段的方法。更為重要的是，引入了一種早期的質控方法，可以在測序前快速檢測隨機自連的噪聲比例，通過該方法，可以極大的降低實驗所需時間和花費，正是因為這些改進，我們將DLO Hi-C用于研究K562細胞系的基因組三維結構。
研究結果
1. DLO Hi-C的理論驗證
DLO Hi-C首先通過對細胞進行雙交聯，被固定的染色質緊接著被限制性內切酶消化，然后再將酶切消化后的染色質分別加上兩種不同的20bp的接頭（接頭A和接頭B）。為了防止不同染色質分子間的自連，作者設計了同步酶切與酶連，正因為如此，所有的染色質片段與接頭的連接都是不可逆的。（Fig. 1）。
2. 測序前的快速質控
為了在測序前評估隨機連接的噪聲情況，作者在DLO Hi-C流程中引入了早期質控步驟，設計了兩個不同的接頭A和接頭B，如果連接發生在染色質內的交聯復合物中，將形成A-A或者B-B結構。如果連接發生在不同分子中（隨機連接），形成的A-B或者B-A結構將不含有任何酶切位點。因此，可以通過酶切對得到的DLO Hi-C DNA片段進行消化處理，以此來評估隨機連接的比例。經過定量檢測發現92%的 DLO Hi-C 文庫DNA被酶解了，這也證實了DLO Hi-C 文庫的信噪比很高（Fig. 2）。
3. DLO-HiC/原位Hi-C與其它Hi-C技術的比較
在高通量測序后，結合生信分析，檢測了A-A、B-B以及A-B、B-A連接所占的比例，結果顯示只有3.0%的測序序列是A-B或者B-A連接，這個結果也與上面的早期質控結果相近。在其它Hi-C方法中，是沒有辦法評估分子間的連接概率的。
為了更好的評估DLO-HiC的質量，作者利用K562細胞系比較了DLO Hi-C, 原位DLO Hi-C以及其它的Hi-C 方法(original Hi-C, DNase Hi-C以及原位Hi-C)在其基因組三維結構上的差別。經過分析發現，雖然它們具有不同的噪音水平和測序深度，但是卻發現了相似的互作關系（Fig. 3）。
同時作者也比較三種Hi-C方法（DLO Hi-C :253 million raw reads, 原位DLO:632 million raw reads以及原位Hi-C:1.37 billion raw reads）關于A/B compartments、TADs和chromatin loops（染色質環）的分析，這三種分析方法在A/B compartments和TADs分析上具有高度的一致性。通過原位DLO Hi-C方法，從632million的原始序列中鑒別到了12780個loops，這里面有4177個通過原位Hi-C也可以鑒定得到。此外，作者做了APA分析三種方法的信噪比，結果顯示原位DLO Hi-C相對來說具有較高的信噪比（Fig. 4）。
討論
染色體構象捕獲技術在過去十年中有了很多改進，并極大的推動了基因組三維結構的研究。 自原位Hi-C技術發明以來，Hi-C文庫的信噪比不斷增加。在這項研究中，作者開發了另一種Hi-C方法，即僅需要消化連接的Hi-C，這項技術僅需要在主要實驗步驟中進行兩輪消化和連接以探索3D基因組結構。作者利用這項技術成功的探索了基因組的三維結構和染色體易位，這項技術有助于探索全基因組的三維結構以及相關的研究。
DLO Hi-C的三個主要優勢：
1. DLO Hi-C是一種簡單且高效的實驗方法。
當前Hi-C方法有一些限制包括復雜和昂貴的Hi-C文庫構建過程和高測序成本。通過DLO Hi-C，只需執行兩輪簡單的消化和連接步驟即可獲得高質量的文庫。
2. 高信噪比。
降低背景噪音是Hi-C實驗中的主要挑戰之一。 DLO Hi-C使用多種措施來減少噪音。首先，作者對染色質進行雙交聯。其次，在接頭連接步驟中，使用限制性內切酶（如HindIII）和DNA連接酶同時消化和連接染色質片段和DNA接頭。通過同時執行這些步驟，幾乎可以完全避免不同染色質片段之間的連接。最后，目前的Hi-C方法通過珠子拉下生物素標記的DNA片段來去除DNA噪音，這也導致會拉下非鄰近連接環化的生物素標記的懸掛末端并產生噪聲數據。
3. 快速的早期質控
使用DLO Hi-C方法，可以直接評估隨機連接噪聲的水平，只需在深度測序前用限制性內切酶消化最終文庫即可。該步驟只需要2小時進行酶消化和DNA電泳。在DLO Hi-C方法中，早期的質量控制步驟使我們第一次了解高通量測序前隨機分子間連接噪聲水平的評估。
借助DLO Hi-C方法的優勢，作者成功將其應用于K562和THP-1細胞系，以揭示其三維基因組結構并鑒定出染色體易位。此外，DLO Hi-C可以在沒有參考基因組的情況下評估噪音。通過這種方式，可以使用高精度的DLO Hi-C數據來協助未知物種和宏基因組研究的基因組組裝。DLO Hi-C方法也可用于研究三維基因組結構、遠程基因調控和染色體易位。
總之，作者成功開發了一種簡單、低成本、低噪音的DLO Hi-C技術，可用于全基因組染色體構象捕獲。這項技術為進一步探索基因調控和三維基因組結構鋪平道路，同時還可以促進基因組組裝、染色體易位分析和宏基因組學研究。