【本文作者為文章一作南京鼓樓醫院江波博士】
遠處轉移是導致癌癥死亡的主要原因。臨床上，經?？捎^察到原發腫瘤對特定器官的轉移傾向；例如，乳腺癌常轉移至顱內，前列腺癌多侵犯骨骼，腎癌（RCC）最常轉移至肺臟，并且不同器官轉移的腫瘤通常呈現出不同的藥物治療反應和預后。目前，大多數腫瘤肺轉移的分子基礎仍不清楚。

既往研究顯示，在腎癌(RCC)中，不同器官的轉移灶顯示出獨特的基因改變特征；譬如，8p和18q染色體的缺失以及12號染色體的擴增在肺轉移中十分常見。雖然轉移病灶與原發腫瘤間共享著絕大多數突變，但特征性突變是驅動器官特異性轉移進化的重要因素。臨床上RCC這種肺轉移特征的具體機制仍需進一步解析。

2022年7月16日，南京大學醫學院附屬鼓樓醫院郭宏騫教授團隊與南京大學生命科學學院閆超課題組合作在國際著名期刊Nature Communications（2022 IF:17.694）上發表了題為“Lysosomal Protein Transmembrane 5 Promotes Lung-Specific Metastasis by Regulating BMPR1A Lysosomal Degradation”的研究成果。在這項工作中，研究團隊探討了驅動腎細胞癌肺特異性轉移的機制。南京大學醫學院附屬鼓樓醫院泌尿外科郭宏騫教授與南京大學生命科學學院閆超教授為共同通訊作者，南京鼓樓醫院江波博士、趙曉智副主任醫師為該論文共同第一作者。吉凱基因提供了慢病毒和TMT蛋白質組學服務。

研究方法

體內構建RCC多器官轉移模型，迭代篩選肺轉移傾向的細胞亞型；轉錄組分析篩選鑒定出特異性肺轉移的關鍵介導分子LAPTM5；表型上，通過慢病毒體系（吉凱基因）構建穩轉細胞株，體內外實驗驗證功能；機制上，通過TMT蛋白質組學（吉凱基因），篩選鑒定出關鍵結合蛋白WWP2；基于此，進一步解析LAPTM5通過促進BMP受體BMPR1A經溶酶體途徑降解的機制。

研究結果

1. 構建具有高度肺轉移傾向性的腎癌（RCC）細胞系

研究者通過對熒光素酶標記的小鼠RCC細胞系Renca^luci細胞進行多次心內接種和轉移克隆篩選/擴增，最終篩選到了有高度肺轉移傾向性的細胞系Renca^LuM2a以及有高度腦轉移傾向的Renca^BrM2b和有高度骨轉移傾向的Renca^BoM2。在接種Renca^LuM2a后11天，8只小鼠中的6只發生了肺轉移，而接種母細胞系（Renca^luci）的10只小鼠中僅1只小鼠發生轉移。此外，接種Renca^LuM2a的小鼠有顯著更短的生存期。小鼠肺部生物發光圖像檢測發現在接種Renca^LuM2a或另一個人786O細胞系來源的高度肺轉移傾向性的細胞786O^LuM1a后均有增強的肺轉移活性。

2. LAPTM5介導肺轉移而非腦或者骨轉移
研究者對獲得的具有不同器官轉移傾向性的Renca細胞系進行轉錄組測序。PCA結果顯示，肺轉移傾向性的Renca^LuM2a和腦轉移傾向性的Renca^BrM2b相鄰，且均與Renca^BoM2或母細胞Renca^luci遠離。這一結果與此前報道稱肺轉移和腦轉移有共有的介導因子相一致。研究者將Renca^LuM2a分別和Renca^BrM2b、Renca^BoM2或Renca^luci相比，分別得到562、942和276個上調基因，其中共有基因為69個，與一個已公開的人RCC數據進行比較，找到3個重合基因，分別是組織蛋白酶S（CTSS）、溶酶體跨膜蛋白5（LAPTM5）和胰島素樣生長因子結合蛋白5(IGFBP5)。其中LAPTM5在Renca^LuM2a中更顯著上調，且其上調僅在肺轉移中被檢測到，而在腦和骨轉移中并未被檢測到。這些結果表明，LAPTM5可能與RCC的肺轉移相關。

研究者隨后對Renca^LuM2a細胞分別進行LAPTM5過表達和敲低，并檢測其在體內對腎癌肺轉移的影響。結果表明，過表達LAPTM5顯著加速腎癌肺轉移，而敲低LAPTM5則顯著抑制肺轉移。LAPTM5的變化并不影響骨和腦轉移。786O^LuM1a細胞上也得到了類似的結果。此外，在Renca^BrM2b和Renca^BoM2中異位表達LAPTM5能改變這兩種細胞的親器官性，增強細胞轉移到肺部的能力。

3. LAPTM5促進RCC細胞自我更新和腫瘤干細胞樣特性

隨后，研究者探索LAPTM5究竟影響了RCC的哪些功能而促進了肝轉移。在排除了LAPTM5對細胞增殖、EMT、侵襲及凋亡的影響后，研究者關注LAPTM5對細胞自我更新能力的影響。將Renca^LuM2a和Renca^luci細胞通過尾靜脈注射入小鼠，并觀察不同時間點小鼠肺組織中的癌細胞滲入情況。結果表明，過表達LAPTM5不能加強Renca^luci滲入肺組織，但敲低LAPTM5可以抑制肺基質中Renca^LuM2a的生長。綜合以上結果表明，LAPTM5可能誘導了肺基質中轉移的起始和腫瘤的生長。緊接著，作者通過3D腫瘤球體形成實驗明確LAPTM5參與細胞自我更新，且LAPTM5可增強癌細胞在皮下和被膜下的腫瘤起始。

此外，研究者還注意到，在侵襲性和轉移性RCC的4個最常見胚胎干細胞轉錄因子NANOG、OCT4、SOX2和KLF4中的3個在LAPTM5過表達的Renca和786O細胞中高表達。這意味著，LAPTM5可能促進和保持了RCC細胞干細胞樣特性。

4. LAPTM5調控腫瘤干細胞特性和介導肺特異性轉移的機制

（1）LAPTM5抑制BMP信號
研究者通過對TCGA數據庫中腎透明細胞癌和乳頭狀腎細胞癌數據的GSEA分析發現，BMP信號通路是唯/一/一條與LAPTM5顯著負相關的信號通路。研究者在肺組織中檢測到了高水平的Smad 1/5/8磷酸化，因此研究者專注于BMP途徑。通過后續實驗明確LAPTM5通過抑制肺微環境中BMP信號的激活來增強RCC細胞的干細胞樣特性。

（2）LAPTM5在轉錄后水平下調BMPR1A
據報道，BMP類似于其他TGF-β家庭成員，它們通過兩種絲氨酸-蘇氨酸激酶跨膜受體——I型和II型BMP受體（BMPR）發揮作用。研究者探究LAPTM5是否可以在RCC中調控BMP。RT-PCR結果顯示，除Bmpr1和Acvr1c外，其他BMPR均在Renca細胞中表達，且BMPR mRNA表達水平不受LAPTM5的影響。然而，10ng/ml的小鼠BMP4處理后，在LAPTM5過表達的Renca細胞中，BMPR1A蛋白水平隨著處理時間逐漸降低，而BMPR1A的mRNA水平不受影響。在786O細胞中也得到了類似的結果。對應地，BMPR1A蛋白水平在LAPTM5沉默的RencaLuM2a細胞中上調。綜合這些結果表明，LAPTM5通過轉錄后機制負調控BMPR1A。

（3）LAPTM5促進BMPR1A溶酶體內吞且與WWP2結合
為了研究LAPTM5是如何調控BMPR1A的，研究者在786O細胞和Renca細胞中分別過表達flag-LAPTM5，并使用TMT蛋白質組學對flag-LAPTM5 CO-IP后的產物進行檢測以尋找LAPTM5結合的蛋白。TMT蛋白質組學分別檢測到了151和131個蛋白，其中有9個共有蛋白。后續實驗明確了LAPTM5和其中一個共有蛋白WWP2（含WW結構域的E3泛素蛋白連接酶2）結合，且BMPR1A也在同一個蛋白復合體中。LAPTM5和WWP2的結合需要WW3結構域，而C2結構域以及前兩個及最后一個WW結構域并不重要。隨后的實驗表明，LAPTM5促進了BMPR1A的內吞作用。

（4）WWP2介導BMPR1A基于溶酶體的泛素化和降解
WWP2是一種泛素連接酶，研究者明確了WWP2可以泛素化BMPR1A，而這種作用會被LAPTM5加強。總體上，WWP2促進了BMPR1A的多泛素化，基于LAPTM5/WWP2的溶酶體途徑介導了BMPR1A的降解。

5. LAPTM5和BMPR1A負相關，且可以預測肺轉移

研究者繼續在臨床樣本中檢測了LAPTM5和BMPR1A的表達模式。結果表明，LAPTM5在肺轉移樣本中顯著高表達，而BMPR1A在肺轉移樣本中低表達。在RCC轉移中，LAPTM5和BMPR1A表達呈密切負相關關系。在原發癌樣本中也檢測到了類似的結果。單變量和多變量邏輯回歸分析顯示，LAPTM5和組織學分級一樣，是RCC肺轉移的獨立預測因子。高LAPTM5表達的原發RCC患者有更少的轉移性無生存和總生存。LAPTM5表達水平可作為RCC患者肺轉移和生存的獨立預后因子。

6. LAPTM5在多種癌癥的肺轉移中被特異性激活

研究者分析已報到的其他癌種的數據發現，LAPTM5在多種癌種肺轉移中高表達。在小鼠4T1^luci細胞（小鼠乳腺癌細胞）和人MDA-MB-231乳腺癌細胞系中過表達LAPTM5可以促進腫瘤球體形成，沉默LAPTM5抑制球體形成。LAPTM5還增加了4T1^luci細胞在接種入乳腺時在體內形成原位腫瘤的能力。更重要的是，LAPTM5過表達導致肺內轉移性病變形成的增加，而LAPTM5敲低則顯著抑制肺轉移。沉默LAPTM5加速了MDA-MB-231細胞中對BMP4處理反應的Smad 1/5/9的磷酸化。免疫沉淀也證實了4T1luci細胞中LAPTM5和WWP2的相互作用。在MDA-MB-231中同時檢測到了LAPTM5和BMPR1A的共定位。用10ng/ml BMP4處理細胞，BMPR1A斑點顯著增加，且LAPTM5過表達促進了MDA-MB-231細胞中BMPR1A的內吞。WWP2也被發現結合BMPR1A并促進其在MDA-MB-231細胞中的降解。總之，這些數據顯示，肺轉移中LAPTM5的活化是多種人類癌癥的共同分子事件，并且基于LAPTM5/WWP2的溶酶體調節途徑介導了BMPR1A泛素化和降解。

研究結論
高肺轉移傾向的RCC細胞亞型進行組學分析，結合臨床樣本驗證，鑒定出肺轉移關鍵分子LAPTM5。驗證發現，LAPTM5在肺轉移細胞株中特異性活化，外源性操控LAPTM5的表達顯著影響小鼠體內RCC細胞的肺轉移潛能，但對骨轉移和腦轉移潛能沒有明顯影響。表型方面，LAPTM5并不影響RCC細胞的增殖、遷移、侵襲以及抗凋亡能力，但可顯著促進肺部定植的循環RCC細胞在肺部微環境中的活化。檢測發現，LAPTM5能夠上調RCC細胞中NANOG、OCT4、SOX2等干性基因的表達，促進RCC細胞的體內外成瘤能力。對TCGA數據庫中的透明細胞型（KIRC）與乳頭細胞型（KIRP）腎癌隊列樣本進行GSEA分析，發現BMP通路可能是LAPTM5負調控的關鍵通路。LAPTM5可通過下調BMP的受體BMPR1A來抑制BMP信號，從而激活RCC細胞在肺組織中的生長。在機制上，LAPTM5能夠促進BMPR1A的內吞以及與WWP2（一種E3泛素化連接酶）的結合，進而介導BMPR1A的溶酶體泛素化途徑降解。最后，研究人員在臨床RCC原發腫瘤及轉移灶樣本中驗證了上述機制。有意思的是，LAPTM5在肺轉移細胞系中特異性活化的現象在其他腫瘤如乳腺癌、黑色素瘤以及結直腸癌中也得到了初步驗證，提示LAPTM5上調可能是多種腫瘤肺轉移的共性機制。這一新的肺轉移機制可為多種癌癥的肺轉移提供新的潛在藥物研發靶點。

LAPTM5促進腫瘤特異性肺轉移的作用模式圖

吉凱助力
此項研究中吉凱基因提供了慢病毒和TMT蛋白質組學服務。

此項研究南京大學醫學院附屬鼓樓醫院泌尿外科郭宏騫教授與南京大學生命科學學院閆超教授為共同通訊作者，南京鼓樓醫院江波博士、趙曉智副主任醫師為該論文共同第一作者。

左:郭宏騫教授；右:江波博士

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