01

什么是樹突狀細胞（DC）？

DC細胞是“Dendritic Cell”，中文名稱是樹突狀細胞。樹突狀細胞是人體內最有效的抗原遞呈細胞（antigen presenting cell, APC）。DC細胞是唯一能夠顯著刺激初始T細胞增值的APC，其他種類的APC（如單核巨噬細胞，B細胞等）僅能刺激已活化的或者記憶性的T細胞，因此DC細胞是適應性T細胞免疫應答的始動者，在腫瘤免疫中發揮著及其重要的作用。DC 表面高表達MHC -I和MHC -II類分子，具有特異性表面標志的細胞。其對抗原攝取，加工以及刺激T細胞使其激活，并最終決定T細胞的分化方向。

02

DC的來源

DC細胞在體內含量甚微, 從體內直接分離出DC耗時而且細胞產量很低，這極大地限制了DC的研究和應用。但DC能從不同組織里的DC前體細胞分化、誘導而來, 如骨髓液的前體細胞，外周血和臍帶血的單核細胞。

對于人，由于人外周血的取材最為方便且單核細胞數量最多，所以最常用的方法是從人外周血單個核細胞(PBMC)誘導DC。而對于小鼠，最常見的方法是從骨髓細胞誘導產生DC，即骨髓來源的DC(Bone Marrow-Derived Dendritic Cells，BMDC)。

圖1.經典的 BMDC 制備方法簡圖

03

BMDC制備方法

常見的小鼠BMDC制備方法有：

 01 經典的BMDC培養法-Inaba法（改良）；02 BMDC的大量制備法-Sons法；03 

BMDC的大量制備法—Lutz法。

經典的BMDC培養法-Inaba法（改良）

背景

1. Inaba法獲得的BMDC 數目為5-7 x 106個/小鼠； 

2. Inaba原法僅用GM-CSF來誘導BMDC的產生，雖然得到的BMDC在混合淋巴細胞反應中有較強的刺激能力，但DC的成熟度不及GM-CSF+IL-4的聯合誘導，所以后來的改良法中多用GM-CSF+IL-4聯合誘導。

培養步驟

1. 小鼠骨髓細胞的獲得

1.1 小鼠(6-10周齡)頸椎脫臼法處死，手術取出所有股骨和脛骨，并剪刀和鑷子將骨周圍的肌肉組織盡量去除干凈；【注】：不要損傷到骨。
1.2 將骨移至超凈臺內，并用盛有70%酒精的無菌培養皿浸泡2-5min，以消毒滅菌，然后用無菌的PBS洗2次； 
1.3 將骨移入另一個盛有PBS 的新培養皿中，用剪刀剪去骨兩端，再用注射器抽取PBS，針頭分別從骨兩端插入骨髓腔，反復沖洗出骨髓至培養皿中，直至骨完全變白； 
1.4 收集骨髓懸液，用200目尼龍網濾去小碎片和肌肉組織； 
1.5 過濾液1200rpm 離心5min，棄上清；
1.6 加入2 ml氯化銨紅細胞裂解液(1x)，重懸細胞，室溫孵育3-5min，最長10min；
1.7 加入10 ml PBS 中和裂解液的作用，然后1200 rpm 離心5min，棄上清;
1.8 PBS 洗1 次，然后用含10% FBS的RPMI1640培養液重懸細胞，至此已獲得小鼠骨髓細胞。

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氯化銨紅細胞裂解液的配制： 

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1）先配制10x的貯存液，配法如下：稱取82.9g NH4Cl，10.0gKHCO3和0.37g Na2EDTA，溶于1L的蒸餾水中，0.22μm濾膜過濾除菌，4℃儲存6個月；

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2）臨用前，將10x貯存液用無菌蒸餾水1 : 9稀釋成1x工作液即可。

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【注】：因氯化銨紅細胞裂解液對骨髓細胞有一定的傷害作用，所以要盡量縮短溶血時間。

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2. BMDC 的誘導分化

2.1 步驟1中獲得的小鼠骨髓細胞計數后用含10% FBS的RPMI 1640完全培養液調整細胞濃度為0.5-1x 106/ml； 
2.2 鋪至24 孔培養板內，每孔1ml 細胞，同時加入重組小鼠GM-CSF (20ng/ml)和IL-4 (10ng/ml)，37℃，5% CO2培養箱培養，此為培養的第0天；

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【注】：

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1) 一般一只小鼠大約可收獲4-5x107個骨髓細胞，所以可以鋪至少40-50個24 孔板板孔。
2)GM-CSF 和IL-4 的使用濃度區間分別為20-50ng/ml 和10-40ng/ml。 

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2.3 每2天輕輕搖晃培養板，然后3/4 體積更換新鮮培養液，并補足細胞因子。 
2.4 在第5天和第8天之間，輕柔吹打培養液，收集懸浮細胞及疏松貼壁生長的細胞； 
2.5 1200rpm離心5min，棄上清； 
2.6 用含10% FBS的RPMI 1640完全培養液重懸細胞并計數，然后調整細胞濃度至1×106/ml，并加入重組小鼠GM-CSF (20 ng/ml)和IL-4 (10ng/ml)； 
2.7 細胞鋪板至100mm培養皿(每皿最多10ml)或6孔培養板(2m/孔)。 
2.8 37℃，5% CO2培養箱繼續培養1-2天；
2.9 收集懸浮細胞，即為較成熟的BMDC。

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【注】：

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1）第2.5-2.8步為再鋪板步驟，目的是使第2.4步獲得的BMDC更加成熟。
2）再鋪板后的3h內可見許多棘狀貼壁細胞從DC簇中遷移出來，而培養1天后會發現這些貼壁細胞從培養板底脫離，而且可以看見在培養液中漂浮著許多典型的DC。

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3. BMDC的完全成熟 

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【注】：

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步驟2中獲得的BMDC并非完全成熟的DC，若想得到完全成熟的DC，還需LPS，CD40L 或TNF-a 等的誘導。

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3.1 步驟2.4 或2.9 中獲得的BMDC以1200rpm離心5min，棄上清； 
3.2 用含重組小鼠GM-CSF (20 ng/ml)和IL-4 (10ng/ml)的RPMI完全培養液重懸沉淀，計數后調整細胞濃度為1×106/ml；
3.3 加入24 孔培養板中，并加入成熟誘導劑，如TNF-α (250U/ml)，LPS (1μg/ml)、或CD40L(1μg/ml)等； 
3.4 37℃，5% CO2 培養箱培養2天； 
3.5 收集懸浮細胞及疏松貼壁生長的細胞即為成熟樹突狀細胞。

BMDC大量制備法-Son 法  

背景

1. 該法可在7天內獲得30-40×106個DC/小鼠，是Inaba 經典方法的7-10 倍。DC經14.5%甲泛葡胺(Metrizamide)梯度離心后，純度(即CD11c+/I-Ab+細胞)可達85-95%。 
2. 該法獲得的DC 的內吞能力弱于Inaba 經典方法，但分泌的IL-12p70 量相似； 
3. 該法獲得的DC 在混合淋巴細胞反應中比Inaba 經典方法呈現更強的刺激能力； 
4. 該法獲得的DC 能引起更強的特異性T 細胞反應； 
5. 綜上，Son法比經典方法能獲得更多、更成熟的BMDC。 

培養步驟

1. 小鼠骨髓細胞的獲得 
見Inaba 法(改良)中的相應步驟。

2. BMDC 的大量制備 
2.1 步驟1 中獲得的小鼠骨髓細胞計數后用含10% FBS 的RPMI 1640 完全培養液調整細胞濃度為2× 105 /ml； 
2.2 鋪至6 孔培養板內，每孔5ml 細胞，同時加入重組小鼠GM-CSF (1000U/ml)和IL-4 (1000U/ml)，37℃，5% CO2 培養箱培養；
2.3 在培養的第4天，向培養體系中補充重組小鼠GM-CSF (1000U/ml)和IL-4(1000U/ml)； 
2.4 培養的第7天收集DC，用2-4ml RPMI 1640完全培養液重懸，加至等體積的14.5%(w/v) 甲泛葡胺上，1200xg 室溫離心20min；

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 【注】

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此時的DC 為不完全成熟的BMDC，要想進一步成熟，請跳至步驟3。

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2.5 收集中間層，并用RPMI 1640完全培養液洗3次備用。

3. BMDC 的完全成熟 
3.1 步驟 2.4 中收集的BMDC，重新鋪板，并向培養體系中加入重組小鼠GM-CSF(1000U/ml)和IL-4 (1000U/ml)，以及LPS (1-10μg/ml) 
3.2 37℃，5% CO2 培養箱培養2天，獲得成熟的BMDC。

BMDC大量制備法-Lutz 法

背景

1. Lutz法與Son法相似，均可大量制備BMDC，但與Son法相比，Lutz 法更為廣泛地被采用。 
2. 該法可獲得更多的BMDC，達1-3 x 108個DC/小鼠，而且純度可達90-95%； 
3. 該法比Son 法使用的細胞因子濃度低得多，僅為200U/ml，而且培養的第8天到第10天降為30-100U/ml，這樣可以大幅節約試劑成本； 
4. 該法與Inaba 經典方法和Son法的最大不同是使用細菌培養皿(Petri dish)而非細胞培養板來培養骨髓細胞。Inaba的解釋是細菌培養皿不容易使骨髓中的巨噬細胞貼壁，從而抑制巨噬細胞的發育，進而避免巨噬細胞對DC 成熟的抑制作用，這可能是該法能夠以較低鋪板密度獲得大量BMDC的主要原因。 
5. 但該法的培養時間較長，需要10-12天，一方面是為了獲得更多的BMDC，另一方面，大多數粒細胞和淋巴細胞很難存活這么長時間，因此可提高最終獲得的BMDC 的純度； 
6. 該法僅用GM-CSF 進行誘導培養，得到的BMDC中未成熟和成熟DC均有，若要進一步提高成熟度，需用LPS或TNF-α再誘導1-2天，其中成熟DC細胞的含量將達到50-70%。

培養步驟

1. 小鼠骨髓細胞的獲得 
見Inaba 法(改良)中的相應步驟，注意省去溶血步驟。

2. BMDC 的大量制備
2.1 步驟1中獲得的小鼠骨髓細胞計數后用含10% FBS 的RPMI 1640完全培養液調整細胞濃度為2×105/ml； 
2.2 鋪至100mm 細菌培養皿(Petri Dish)中，每皿10ml 細胞，同時加入重組小鼠GM-CSF (200U/ml)，37℃， 5% CO2 培養箱培養； 

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【注】：

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此處使用的是細菌培養皿，而非細胞培養板。 

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2.3 第3天時，向培養皿中再加入10ml 含20ng/ml 重組小鼠GM-CSF 的完全培養液； 
2.4 第6天和第8 天分別半量換液，即收集舊培養液，離心后用含20ng/ml 重組小鼠GM-CSF 的完全培養液重懸細胞沉淀，然后再將細胞懸液放回原皿； 
2.5 第10天時可收集細胞，即為BMDC。

3. BMDC 的完全成熟 
3.1 培養第10天的DC用移液器輕輕吹打收集懸浮細胞，300xg 室溫離心5min；
3.2 棄上清，用10ml RPMI 1640 完全培養液重懸細胞沉淀，然后鋪于100 mm 細胞培養板；
3.3 加入重組小鼠GM-CSF(100U/ml )和TNF-α(500U/ml)，或重組小鼠GM-CSF(100U/ml)和LPS (1μg/ml)；
3.4 37℃，5% CO2培養箱繼續培養1-2天。

04

BMDC的鑒定

1. 形態學觀察：BMDC多數呈集落生長，細胞有多個樹突樣突起，成熟的BMDC 更加明顯；

2. 細胞表型分析：流式細胞術檢測DC 細胞表面CD11c，CD40，CD80，CD86，MHCII 類分子(I-A/I-E)等的表達，BMDC高表達這些分子，完全成熟的BMDC中這些分子的表達會進一步提高。

3. 混合淋巴細胞反應(MLR)：BMDC具有較強的刺激能力，且成熟度越高，刺激能力越強。

05

成熟誘導劑該如何選擇？

LPS，CD40L 和TNF-α無論對人DC 還是小鼠DC 均是常用、有效的成熟誘導劑。TNF-a 誘導DC 的成熟能力在三者中最弱。LPS 和CD40L 均是DC 體外完全成熟的強誘導劑，兩者誘導DC 的成熟度相似，但誘導產生的細胞因子譜有差異。CD40L誘導成熟的BMDC 在體內顯示出最強的免疫調節能力，包括保護性和治療性腫瘤免疫反應的產生。用LPS刺激DC完全成熟所用的濃度一般為1-10μg/ml，但其實0.1 μg/ml 已經有非常強的作用，但保險起見，一般選用1μg/ml。對于CD40L 需要注意的是，CD40L 分子屬于TNF 配體家族，該家族的特點是在形成三聚體后才能發揮作用。所以最好能用重組的CD40L三聚體蛋白來刺激DC，這樣會有很好的效果。如果用CD40L 單體來刺激DC，多數情況下成熟度并不是很高。

06

培養方法的選擇

表1.BMDC制備3種實驗方法對比

07

DC培養試劑推薦