組織纖維化，即用非功能性結締組織取代功能性組織，是幾乎所有人體器官遭受損傷后的最終結果。疤痕缺乏皮膚的毛發或腺體，因此缺乏正常的體溫調節或屏障功能。盡管存在巨大的醫學負擔，但目前的治療仍然缺乏，部分原因是對區分再生和纖維化愈合的基本機制的理解有限。
先前作者們工作表明，使用YAP抑制劑阻斷機械轉導可以防止成纖維細胞纖維化，促進成纖維細胞的再生。為了對這一過程進行深度理解，近期美國斯坦福大學醫學院的研究團隊在Cell Stem Cell（中科院JCR一區，IF:24.633）發表了題為“Multi-omic analysis reveals divergent molecular events in scarring and regenerative wound healing”的論文。研究者通過4D蛋白質組學聯合單細胞測序揭示了YAP抑制背景下瘢痕和傷口再生的不同分子軌跡。同時，研究者還揭示了Trps1在驅動傷口再生中的關鍵作用，并表明激活的Wnt和Trps1信號是再生愈合的標志。
模型：小鼠背側夾板切除損傷模型
實驗組：
（1）損傷后2天（POD2，炎性期）
（2）損傷后7天（POD7，成纖維細胞增殖）
（3）損傷后10天（POD10）
（4）損傷后14天（POD14，傷口重新上皮化，成纖維細胞產生ECM）
（5）損傷后21天（POD21）
（6）損傷后30天（POD30，成纖維細胞重塑ECM）
對照組：非損傷皮膚（在損傷部位相似的正常皮膚區域取樣）
傷口處的兩種處理：Verteporfin處理（YAP抑制劑）和不處理（PBS處理）
注：verteporfin(維替泊芬)是一種Yes相關蛋白（YAP）抑制劑，可阻止En-1+成纖維細胞系向組織纖維化方向轉化，使之向皮膚再生轉化。
研究結果
1. YAP抑制劑處理組與對照組的傷口愈合情況
對照組（PBS處理）傷口形成明顯的纖維化瘢痕，裸露的區域有致密、線性排列的細胞外基質纖維，沒有皮膚毛囊和腺體。相比之下，在損傷后30天，YAP抑制劑處理的傷口皮膚毛囊和腺體水平與非損傷皮膚相當，并且含有密度更低、更隨機的ECM纖維。即YAP抑制劑處理后傷口出現皮膚再生，而未處理則生成疤痕。
2. 4D蛋白質組+單細胞測序+細胞外基質超微結構分析纖維化和再生傷口
為了研究不同傷口愈合走向的細胞和分子動力學，研究者對5個關鍵時間點的YAP抑制劑處理和PBS對照處理的傷口組織（生物學重復n=5）進行了多組學檢測。1/3的傷口組織用于組織學檢測，剩余組織通過流式細胞分選出成纖維細胞（Lin+）和非成纖維細胞（主要是免疫細胞；Lin-）。分選后的細胞，一半進行單細胞轉錄組測序，另一半進行4D蛋白質組學檢測。
單細胞測序共對2986個細胞進行了轉錄組檢測，在YAP抑制劑處理的傷口中，成纖維細胞略有增加，和不處理的傷口中細胞比例普遍相似，這表明YAP抑制劑可能是通過改變細胞表型而非通過改變細胞類型內亞群的結構來誘導傷口再生。
4D蛋白質組學的主成分分析顯示不同時間點的Lin-（成纖維細胞）和Lin+（非成纖維細胞）存在差異顯著，而YAP抑制劑處理和PBS對照的差異則相對沒那么明顯。基因集合富集分析(GSEA)顯示，PBS處理的傷口成纖維細胞富集具有機械活化作用的條目，而YAP抑制劑處理則富集與角蛋白和代謝過程相關條目。此外，研究者還發現在YAP抑制劑處理的POD 30（損傷后30天）的細胞中呈現多種膠原（如Col2a1和Col6a2）的顯著增加以及其他纖維化標志物的顯著變化，如Col1a1、Diablo和Cdh11。
由于ECM（細胞外基質）結構/組織是組織屬性的關鍵決定因素，研究者使用新開發的圖像處理算法量化了受傷和非損傷皮膚的ECM超微結構。隨著時間的推移，PBS處理傷口的ECM與非損傷ECM顯著分化，進一步證實了纖維化。相比之下，YAP抑制劑處理傷口（POD 14/30）非損傷皮膚重疊，表明YAP抑制劑治療后的傷口愈合產生了非損傷樣的ECM。在任何一種處理中，POD 7-14之間的差異最大，這與ECM在這個階段沉積相一致。ECM評分顯示POD 14/30處理后恢復了非損傷樣的ECM特征，尤其是在ECM重塑的POD14-30天這一階段。
3. 發現損傷修復的分子軌跡
由于成纖維細胞是高度機械敏感的，且是瘢痕形成的主要驅動因素。研究者假設YAP抑制劑通過改變成纖維細胞表型促進再生，因此集中分析了成纖維細胞的單細胞測序結果。研究者使用Monocle3生成時間已知但處理未知的細胞軌跡。細胞軌跡有兩個分叉的分支，其中早期傷口(POD2)的成纖維細胞靠近分支點，晚期的成纖維細胞則在分支末端。有意思的是，非損傷皮膚的成纖維細胞都專一性地聚集在底部的分支，另外還有相對富集的YAP抑制劑處理的成纖維細胞。因此，研究者假定底部的分支代表了損傷再生修復軌跡，而上面的分支則相對代表了損傷纖維化軌跡。研究者還分析了YAP抑制劑處理和PBS處理后髓樣細胞和淋巴細胞間的差異，結果表明這些免疫細胞并不能區分再生和纖維化。因此，這也進一步驗證了YAP抑制劑誘導的損傷再生是由成纖維細胞而非淋巴細胞調控的。
研究者進一步分析單細胞測序反應出的纖維化和再生軌跡中的獨特特征。成纖維細胞聚類分析共產生6中亞群（簇），簇0和簇4構成了再生軌跡，而簇1、2和5則構成了纖維化軌跡，而簇3則主要有非損傷成纖維細胞構成。纖維化軌跡的基因富集在已知的促纖維化marker如Dpp4。
接下來，研究者關注與假時間對抗性關系最強的基因。與這個分支的再生表型一致，研究者發現多個發展/再生相關基因。研究者還發現了幾個參與Wnt信號傳導的基因(在毛囊生長發育中很重要)，包括Wnt靶點Axin2和Twist1、Wnt激動劑Rspo1、參與胚胎皮膚發育的Dkk2和Dkk3以及Wnt通路調節因子且參與毛囊形態發生的Trps1。富集的Reactome條目包括多個和wnt相關條目以及和調節干細胞多能性的信號通路。接下來，研究者使用了SCENIC平臺比較了兩條細胞軌跡。Trps1、Gli1和Twist1調控基因在再生軌跡中更被激活，這進一步說明了Wnt的激活。研究者還使用CellChat分析了單細胞測序數據，CellChat使用已知的配體-受體相互作用來推斷細胞間通信。CellChat分析結果強調了涉及疤痕成纖維細胞和再生軌跡中非典型Wnt信號的促炎信號(如CXCL和IL6)的增加。
4. 單細胞測序和4D蛋白質組數據聯合分析
研究者對單細胞測序結果與4D蛋白質組學結果進行聯合分析。首先明確了，mRNA與蛋白并不對等（平均相關性<0.5），但是基因和蛋白在通路層面上存在一致性。研究者使用推斷分析，將研究者的scRNA-seq數據集中的蛋白質表達映射到細胞上。與單細胞測序結果一致，機械信號蛋白如Ankrd1和Dag1在POD2/7纖維化軌跡中表達更高。在纖維化軌跡中富集蛋白的GSEA結果顯示出與生長因子信號、機械信號和收縮性相關的條目以及ECM沉積/組織和ECM成分的強烈富集。相反，再生軌跡則缺乏機械信號傳導、收縮性或ECM相關的條目的富集，這與單細胞測序相一致。接下來，研究者將單細胞測序與ECM結構和毛囊/腺體計數的變化相關聯?？偟膩碚f，再生軌跡與非損傷樣ECM相關，纖維化軌跡與疤痕樣ECM相關。緊接著，研究者對POD 0(非損傷)、2、7、14和30時的PBS和YAP抑制劑處理的傷口的ECM參數進行了無監督聚類分析，共產生7個不同的特征簇。通過分析不同的特征簇和傷口的特征，最終表明成纖維細胞是造成PBS和YAP抑制劑治療愈合差異的的主要驅動因素。
5. Trps1或為損傷纖維化軌跡和損傷再生軌跡中的marker
PBS和YAP抑制劑處理治療的傷口之間的顯著差異是后者在30天出現再生毛囊，而對照組創面形成裸露區域。研究者想知道成纖維細胞軌跡分析是否可以揭示毛囊/腺體再生的主調節因子。Trps1是一種在再生軌跡中強烈富集的鋅指轉錄因子，成為了候選基因。Trps1曾被報道為Wnt信號的新型“主調節器”，在毛囊的發展、生長和增殖中至關重要，這使其成為驅動傷口毛囊再生的一個有前途的候選者。鑒于再生軌跡的特點是機械轉導減少和Trps1升高，研究者推測Trps1可能是傷口再生的關鍵調控因子。
研究者進行了真皮限制性形態學重建。在POD 14的YAP抑制劑處理傷口中，在真皮淺表中發現表達Rspo1和Trps1 RNA顆粒的成纖維細胞聚集在內陷上皮區域周圍，與新生的毛囊一致。相比之下，POD14 PBS處理創面中的Rspo1+和Trps1+細胞隨機分散在真皮中。POD 30是纖維化和再生創面之間表型差異最大的時間，PBS創面成纖維細胞有更多的Dpp4和Ankrd1，而YAP抑制劑處理創面有更多的Rspo1和Trps1，集中在再生毛囊周圍。從數千個細胞的定量證實了這些趨勢，支持了ENF（En-1陰性成纖維細胞）介導的YAP抑制(低Ankprd1)傷口的愈合(低Dpp4)通過Wnt激活(高Trps1和Rspo1)產生毛囊再生的觀點。
6. Trps1在損傷再生中的功能重要性
考慮到Trps1在Wnt信號傳導、毛囊形態發生和YAP調控中的重要性，以及Trps1+成纖維細胞與毛囊再生關系，研究者進一步研究了Trps1在傷口再生中的作用。研究者在傷口修復的不同階段（早期：POD-3和7，記作Trps1-OEE；晚期：POD7和17，記作Trps1-OEL）的成纖維細胞中特異性過表達Trps1，并在POD 30時收集傷口樣本，以研究其在傷口愈合不同階段的作用。結果顯示，對照組（未過表達Trps1,記作Trps1-OEC）傷口形成瘢痕，而Trps1-OEE和Trps1-OEL傷口瘢痕不明顯，且有再生毛囊。此外，在Trps1-OEE和Trps1-OEL傷口中顯示少量再生附件結構和更多的非損傷樣ECM。與Trps1-OEL傷口相比，Trps1-OEE傷口的再生更為顯著，這表明Trps1的促再生作用可能在早期愈合時最大。綜上所述，這些發現表明Trps1過表達足以促進傷口再生。
接下來，為了評估Trps1是否對YAP抑制劑誘導的傷口再生是必要的，研究者分別在YAP抑制劑處理傷口的早期(POD-3/7，記作Trps1-KDE）和晚期(POD7/17，記作Trps1-KDL)，特異性敲低成纖維細胞中的Trps1，并在POD30時采集樣本，以觀測傷口修復的變化。最終，Trps1-KDC（對照組，未敲低Trps1）創面表現出毛發再生和無瘢痕，而Trps1-KDE和Trps1-KDL創面形成無毛瘢痕。組織學上，Trps1-KDE和Trps1-KDL創面的ECM再生完全消失，而形成瘢痕ECM。有趣的是，僅在Trps1-KDL傷口中觀察到附件結構的顯著丟失，這意味著Trps1在YAP抑制劑誘導的附件再生的愈合中是特別需要的。總的來說，這些數據表明Trps1對于傷口的完全再生是必要的，并且在早期和晚期愈合中具有不同的作用<
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