PE與抗體的綴合實驗方案

注1:整個綴合過程可以在一天內完成。但是，綴合前對 PE 的純化可能需要24-48小時。除了下面列 出的材料外，您還需要濃度至少為 2 mg/ml   的抗體溶液。請您在進行PE 抗體綴合實驗之前熟悉如何使用脫鹽柱以及如何獲取吸光度光譜。

注 2 : SMCC-PE   綴合物非常穩定 (在“交換緩沖液”中，在4C 下至少可以穩定幾個月)。因此， 如果您需要節省一部分時間，可以選擇同時綴合10 毫克或更多的 PE,  并將其用于幾次抗體實驗(在幾周內)。 SMCC-PE    的長期儲存最好是作為飽和硫酸銨沉淀物。

一  .P E 的 制 備

1.將 PE 純化。綴合前的濃度通常為 5-10  mg/ml  。 注意： PE  在綴合前作為 SAS  ( 硫 酸 銨 鈉 ) 沉淀物穩定。如果將 PE   以 SAS   沉淀物的形式儲存，則必須在使用前進行大量純化。

2.使用3 .5毫克R-PE 修飾每毫克lgG, 包括在緩沖液交換過程中損失的額外10%。

3. 檢查 PE 的純度和濃度，請測量280、565 和 6 2 0 nm 處的吸光度。  (1mg/ml      的 PE  在 565nm   處的 OD  為 8 . 2 ) 。 5 6 5 / 6 2 0 比 率 > 5 0 表示已充分去除污染的藻藍蛋白；565/280 比 率 > 5 表示已充分去除所有其他蛋白質。

二 .P E 的 活 化

1.使用前在無水 DMSO   中制備 10  mg/ml 的 SMCC  儲備溶液。

2.每毫克 PE 加 入 1 1 μlSMCC, 并進行渦旋。將反應管用鋁箔包好，室溫下旋轉60 分鐘。

3.將純化的 PE  過凝膠過濾柱來交換緩沖液。

注意：對于失敗或效果較差的結合，增加或減少 SMCC   相對于 PE   的量，可能會有所好轉。

三 . 1gG 還 原

1.在蒸餾水中制備 1 M DTT(15.4mg/100 μl) 的新鮮溶液。

2.1gG  溶液濃度應為 4 mg/ml 或更高，這樣效果比較好。還原幾乎可以在任何緩沖液中進行； MES 、磷酸鹽和 TRIS 緩沖液 (pH 范圍為 6 至8)已被驗證可以使用。如果抗體濃度低于 2 mg/ml,   則應濃縮。緩沖液交換柱上的損失應額外增加10%。

3.用 DTT  配制 20 mMlgG 溶液：每毫升 IgG 溶液加入 20μ lDTT 原液并攪拌。室溫下靜置30分鐘，無需額外攪拌 (以盡量減少半胱氨酸再氧化為胱氨酸)。

4.將還原的lgG 通過預平衡的“交換緩沖液”過濾柱。收集0.25毫升的級分，測定蛋白濃度，并將含有大部分lgG 的級分匯集在一起?？梢酝ㄟ^分光光度法或比色法完成。

5.此步驟后盡快進行綴合。

注意：對于結合較差或失敗的情況，降低 DTT 濃度可能會有所幫助。

四 .進 行 綴 合

1.每毫克 IgG 添 加 3.2 毫克 SMCC-PE。用鋁箔包裹反應管并在室溫下旋轉60 分鐘。注意：這些摩 爾 比 ( 每 IgG 約 2 個 PE)   效果很好。對于失敗或效果不佳的結合，不同的摩爾比可能會有所幫助。

2.60 分鐘后，必須去掉 lgG   上未反應的游離巰基。

3.在 1.0 ml 干 DMSO 中制備 10 mg  NEM  的新鮮溶液。

4.每 毫 克 |gG  添加 34μ g(3.4μl) 。室溫下包裹并旋轉20 分鐘。

2.60 分鐘后，必須去掉 lgG 上未反應的游離巰基。

3.在 1.0 ml 干 DMSO  中制備 10 mg  NEM  的新鮮溶液。

4.每毫克 |gG 添加 34μ g(3.4μl) 。 室溫下包裹并旋轉20 分鐘。