上一期我們介紹了細胞分選在單細胞測序中的適用場景，今天小編帶大家繼續了解常見的細胞分選方式及其應用。
一、 常見細胞分選類型
01
物理分選
細胞分選通常是指根據細胞本身特性把某種特定的細胞亞群從混合的細胞樣品中分離出來，常見的物理分選方法即密度梯度離心法（Density gradient centrifugation），利用懸液中不同顆粒之間存在的沉降系數差，在一定離心力作用下，使顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區域上形成區帶，進而實現特定細胞的分離。
Ficoll和Percoll是常見的密度梯度離心分離劑。Ficoll是蔗糖的多聚體，中性，Ficoll密度梯度離心法是分離、純化PBMC最常用的方法。Percoll的成分是硅化聚乙-烯吡-咯烷酮(polyvinyl pyrolidone, PVP)，無毒無刺激，Percoll硅膠混顆粒懸液具有易成等滲、粘度低、無毒性、不引起細胞聚集等優點。由于Percoll在培養基中顆粒大小不等，其在離心過程中自然形成密度梯度，從而將不同密度的細胞分離出來。將1份10×PBS與9份percoll儲存液混合，制成等滲Percoll懸液，此懸液被認為是100% Percoll懸液，密度為1.1294g/ml。Percoll稀釋度與密度線性相關,實際生產中我們?？赏ㄟ^用1×PBS稀釋100% Percoll懸液，進而獲得適宜密度對進行細胞分離，獲得目的細胞。
密度梯度離心分離細胞
物理分選具有操作相對簡便、對細胞無毒、懸液PH中性或易調為中性等優點，但可以分選的細胞類型有限，同時由于細胞損失量較大，對懸液的起始細胞量要求較高，一般需要細胞量≥5×106才可以嘗試操作，適用于分選體液類樣本中的單核細胞分選、部分樣本的預富集處理等。
02
磁珠分選
磁珠細胞分選（Magnet-Activated Cell Sorting ，MACS)發展于20世紀70年代，其主要原理是將有抗體結合的免疫磁珠與樣品細胞進行孵育，隨后表達有相應抗原的細胞就會特異性的結合在包被有抗體的免疫磁性微粒上，當體系緩慢的經過磁場時，帶有磁珠的細胞就會滯留在磁鐵上，而非目的細胞由于未結合磁珠仍存在于混合細胞懸液中，從而達到分離純化細胞的目的。
磁珠法分選細胞時，根據目標細胞是否直接被磁珠捕獲后分離獲得，可將其分成正選和負選兩種方法。正選是指目標細胞被磁性標記后，通過磁性分離直接分選出被捕獲的目標細胞，也稱為陽選。正選方法只需用一種抗體標記的磁珠便可獲得純度較高的目標細胞，操作簡單直接，但最后洗脫獲取的目標細胞上標記有磁珠，可能對細胞有一定激活作用，致使下游應用受到一定影響。相對的，負選則是將磁性標記于非目標細胞上，通過磁性分離去除非目標細胞，而收集的上清液則包含目標細胞，可被收集獲取，也稱為陰選。負選獲得的目標細胞未被磁珠標記，無需去除磁珠，但為去除非目標細胞，需使用多種抗體標記的磁珠，成本相對較高。
MACS是一種相對高效簡便的細胞分選方法，所需設備簡單且操作簡便，具有高靈敏度、高特異性、對目的細胞刺激較小等優點。基于分選過程對細胞的損耗，磁珠分選對懸液起始細胞量要求較高，需≥ 1×106個細胞才可以嘗試，同時需要有配合磁極、吸附柱等工具進行操作。另外，當目標細胞群占比低于5%時，磁珠分選會有一定比例的非特異性，可能會有一些非目的細胞的富集。磁珠分選后，如果想確認分選結果中目標細胞的占比，仍需通過流式檢測來鑒定分選效果。
03
流式分選
流式細胞儀（Flow cytometer）主要通過接受激光照射后液流內細胞的散射光信號和熒光信號反映細胞的物理化學特性，如細胞的大小、顆粒度以及抗原分子的表達情況等，可對細胞亞群的物理化學特性進行快速定量分析。流式分選（fluorescence-activated cell sorting，FACS）是指熒光驅動的細胞分選技術，即利用分選型流式細胞儀分選標記有熒光素偶聯抗體的細胞樣品，通過調節合適的電壓、補償等，同時結合熒光系統將目的細胞與非目的細胞區分開來。
分選型流式細胞儀通常由液流系統、光路系統、檢測分析系統和分選系統4部分組成。分選功能是通過對鞘液流形成的含有細胞的帶電液滴進行操作而實現，當充以不同電荷的含細胞的鞘液流經帶有恒定電場的偏轉板時，就根據自身所帶的電荷性質產生偏差而落入各自的收集管中，不帶電荷的液滴就進入廢液槽中，從而實現細胞分選的目的。
流式分選原理
流式細胞分選廣泛適用于各種細胞類型，具有高分辨率，被認為是細胞分選的“金標準”，分選所得的細胞純度高、回收率高、且操作環境為全封閉型，不易被污染。但流式分選方法需要專業的分選儀器，操作相對耗時；流式分選需要起始細胞量≧2×105個，分選過程中需要平衡分選時間，流速和電壓，因此需要高水平的技術支持以及專業的操作人員；同時，由于流式分選對細胞刺激較大，分選壓力會損傷細胞，因此對分選出的細胞活性有一定影響。
二、流式分選在單細胞測序中的應用優勢
近年來，單細胞測序技術的快速發展幫助科研工作者們對每個單細胞進行分析，認識單個細胞間的異質性，深入了解包括復雜器官中不同細胞亞型的功能、胚胎發育早期的分化特征、干細胞發育和分化的分子機理、腫瘤免疫微環境的非均質性及癌細胞的亞群分類、神經元細胞分化過程的轉錄調控機制等以往群體樣本研究中傳統高通量測序方法難以攻克的領域。短短數年時間，單細胞測序便取得了飛速的發展以及矚目的成果，在包括神經生物學、免疫學、胚胎發育、癌癥、臨床診斷等多個領域都有諸多應用。
單細胞樣品的制備是單細胞測序分析的第一步，保證細胞的生物完整性是進行單細胞測序的必要條件，也是后續高質量測序數據的有力保障。高活性、無細胞碎片且均一的單細胞懸液可使測序結果在完整性、真實性、數據可重復性得到提升。隨著單細胞研究的不斷推進，現如今已有越來越多的單細胞研究在制備單細胞樣本的時候會結合分選操作，利用細胞分選的方法富集目的細胞群體，縮小研究范圍，對單細胞群體可進一步精細化解讀。
最常見細胞分離的方法包括物理分選、MACS磁珠分選以及FACS流式細胞分選。
流式細胞分選通過適宜的熒光標記目的細胞，經熒光染色或標記的單細胞懸液被高壓壓入流動室內后，在鞘液的包裹和推動下，單列細胞以一定速度從流動室噴口噴出，通過相應熒光檢測及充電，獲得目的細胞，實現單細胞分離。根據細胞表面標記物表達，流式細胞可將表型與功能性輸出（如細胞因子釋放、轉錄因子的產生等）相關聯，讓單細胞測序研究目的性更強，研究更深入。
流式還可以同時進行多個Marker分選，正選負選同時進行。通過以給液滴充以不同的電量，從而調整液滴的偏轉角度，實現多路分選。流式分選適用于分選無磁珠試劑的個性化目標細胞群，尤其適用于罕見細胞族群相關研究。在單細胞測序前，通過流式細胞分選富集稀有細胞，可大大增加實驗數據真實性與可靠性，也可以極大地節約測序成本。同時，流式細胞分選在篩選目的細胞的同時，還可以過濾懸液中的死細胞和碎片雜質等，減少樣本中無效細胞的比例，提高單細胞文庫構建的成功率以及后續的數據質量，讓單細胞測序更有深度與廣度。
吉凱基因在單細胞測序懸液制備中擁有20年臨床樣本處理經驗，能夠高標準制備各種疑難樣本的單細胞懸液，如鈣化血管樣本、腰椎間盤樣本、穿刺樣本等，并根據客戶需求成功進行多例樣本的特定類型細胞富集、稀有細胞富集、活細胞分選等，提供流式分選+單細胞測序一站式服務，化非特異為特異，為客戶的科研保駕護航。
01
物理分選
細胞分選通常是指根據細胞本身特性把某種特定的細胞亞群從混合的細胞樣品中分離出來，常見的物理分選方法即密度梯度離心法（Density gradient centrifugation），利用懸液中不同顆粒之間存在的沉降系數差，在一定離心力作用下，使顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區域上形成區帶，進而實現特定細胞的分離。
Ficoll和Percoll是常見的密度梯度離心分離劑。Ficoll是蔗糖的多聚體，中性，Ficoll密度梯度離心法是分離、純化PBMC最常用的方法。Percoll的成分是硅化聚乙-烯吡-咯烷酮(polyvinyl pyrolidone, PVP)，無毒無刺激，Percoll硅膠混顆粒懸液具有易成等滲、粘度低、無毒性、不引起細胞聚集等優點。由于Percoll在培養基中顆粒大小不等，其在離心過程中自然形成密度梯度，從而將不同密度的細胞分離出來。將1份10×PBS與9份percoll儲存液混合，制成等滲Percoll懸液，此懸液被認為是100% Percoll懸液，密度為1.1294g/ml。Percoll稀釋度與密度線性相關,實際生產中我們?？赏ㄟ^用1×PBS稀釋100% Percoll懸液，進而獲得適宜密度對進行細胞分離，獲得目的細胞。
密度梯度離心分離細胞
Ficoll分離血液中的PBMC
物理分選具有操作相對簡便、對細胞無毒、懸液PH中性或易調為中性等優點，但可以分選的細胞類型有限，同時由于細胞損失量較大，對懸液的起始細胞量要求較高，一般需要細胞量≥5×106才可以嘗試操作，適用于分選體液類樣本中的單核細胞分選、部分樣本的預富集處理等。
02
磁珠分選
磁珠細胞分選（Magnet-Activated Cell Sorting ，MACS)發展于20世紀70年代，其主要原理是將有抗體結合的免疫磁珠與樣品細胞進行孵育，隨后表達有相應抗原的細胞就會特異性的結合在包被有抗體的免疫磁性微粒上，當體系緩慢的經過磁場時，帶有磁珠的細胞就會滯留在磁鐵上，而非目的細胞由于未結合磁珠仍存在于混合細胞懸液中，從而達到分離純化細胞的目的。
磁珠法分選細胞時，根據目標細胞是否直接被磁珠捕獲后分離獲得，可將其分成正選和負選兩種方法。正選是指目標細胞被磁性標記后，通過磁性分離直接分選出被捕獲的目標細胞，也稱為陽選。正選方法只需用一種抗體標記的磁珠便可獲得純度較高的目標細胞，操作簡單直接，但最后洗脫獲取的目標細胞上標記有磁珠，可能對細胞有一定激活作用，致使下游應用受到一定影響。相對的，負選則是將磁性標記于非目標細胞上，通過磁性分離去除非目標細胞，而收集的上清液則包含目標細胞，可被收集獲取，也稱為陰選。負選獲得的目標細胞未被磁珠標記，無需去除磁珠，但為去除非目標細胞，需使用多種抗體標記的磁珠，成本相對較高。
磁珠法分選細胞
MACS是一種相對高效簡便的細胞分選方法，所需設備簡單且操作簡便，具有高靈敏度、高特異性、對目的細胞刺激較小等優點。基于分選過程對細胞的損耗，磁珠分選對懸液起始細胞量要求較高，需≥ 1×106個細胞才可以嘗試，同時需要有配合磁極、吸附柱等工具進行操作。另外，當目標細胞群占比低于5%時，磁珠分選會有一定比例的非特異性，可能會有一些非目的細胞的富集。磁珠分選后，如果想確認分選結果中目標細胞的占比，仍需通過流式檢測來鑒定分選效果。
03
流式分選
流式細胞儀（Flow cytometer）主要通過接受激光照射后液流內細胞的散射光信號和熒光信號反映細胞的物理化學特性，如細胞的大小、顆粒度以及抗原分子的表達情況等，可對細胞亞群的物理化學特性進行快速定量分析。流式分選（fluorescence-activated cell sorting，FACS）是指熒光驅動的細胞分選技術，即利用分選型流式細胞儀分選標記有熒光素偶聯抗體的細胞樣品，通過調節合適的電壓、補償等，同時結合熒光系統將目的細胞與非目的細胞區分開來。
分選型流式細胞儀通常由液流系統、光路系統、檢測分析系統和分選系統4部分組成。分選功能是通過對鞘液流形成的含有細胞的帶電液滴進行操作而實現，當充以不同電荷的含細胞的鞘液流經帶有恒定電場的偏轉板時，就根據自身所帶的電荷性質產生偏差而落入各自的收集管中，不帶電荷的液滴就進入廢液槽中，從而實現細胞分選的目的。
流式分選原理
流式細胞分選廣泛適用于各種細胞類型，具有高分辨率，被認為是細胞分選的“金標準”，分選所得的細胞純度高、回收率高、且操作環境為全封閉型，不易被污染。但流式分選方法需要專業的分選儀器，操作相對耗時；流式分選需要起始細胞量≧2×105個，分選過程中需要平衡分選時間，流速和電壓，因此需要高水平的技術支持以及專業的操作人員；同時，由于流式分選對細胞刺激較大，分選壓力會損傷細胞，因此對分選出的細胞活性有一定影響。
二、流式分選在單細胞測序中的應用優勢
近年來，單細胞測序技術的快速發展幫助科研工作者們對每個單細胞進行分析，認識單個細胞間的異質性，深入了解包括復雜器官中不同細胞亞型的功能、胚胎發育早期的分化特征、干細胞發育和分化的分子機理、腫瘤免疫微環境的非均質性及癌細胞的亞群分類、神經元細胞分化過程的轉錄調控機制等以往群體樣本研究中傳統高通量測序方法難以攻克的領域。短短數年時間，單細胞測序便取得了飛速的發展以及矚目的成果，在包括神經生物學、免疫學、胚胎發育、癌癥、臨床診斷等多個領域都有諸多應用。
單細胞樣品的制備是單細胞測序分析的第一步，保證細胞的生物完整性是進行單細胞測序的必要條件，也是后續高質量測序數據的有力保障。高活性、無細胞碎片且均一的單細胞懸液可使測序結果在完整性、真實性、數據可重復性得到提升。隨著單細胞研究的不斷推進，現如今已有越來越多的單細胞研究在制備單細胞樣本的時候會結合分選操作，利用細胞分選的方法富集目的細胞群體，縮小研究范圍，對單細胞群體可進一步精細化解讀。
最常見細胞分離的方法包括物理分選、MACS磁珠分選以及FACS流式細胞分選。
_ | 流式分選 | 磁珠分選 | 物理分選 |
| 適用范圍 | 范圍廣 | 熱門細胞類群 | 特定細胞類型 |
| 細胞損傷 | 壓力損傷 | 無 | 無 |
| 細胞損失 | 低 | 低 | 較高 |
| 時間 | 1h以內 | 1h以內 | 1-2h |
| 特異性 | 高 | 較高 | 一般 |
| 其他鑒定 | 否 | 流式檢測 | 流式檢測 |
| 起始細胞量 | 2.00E+05 | 1.00E+06 | 2.00E+06 |
| 特殊儀器 | 流式分選儀器 | 磁極 | 無 |
流式細胞分選通過適宜的熒光標記目的細胞，經熒光染色或標記的單細胞懸液被高壓壓入流動室內后，在鞘液的包裹和推動下，單列細胞以一定速度從流動室噴口噴出，通過相應熒光檢測及充電，獲得目的細胞，實現單細胞分離。根據細胞表面標記物表達，流式細胞可將表型與功能性輸出（如細胞因子釋放、轉錄因子的產生等）相關聯，讓單細胞測序研究目的性更強，研究更深入。
流式還可以同時進行多個Marker分選，正選負選同時進行。通過以給液滴充以不同的電量，從而調整液滴的偏轉角度，實現多路分選。流式分選適用于分選無磁珠試劑的個性化目標細胞群，尤其適用于罕見細胞族群相關研究。在單細胞測序前，通過流式細胞分選富集稀有細胞，可大大增加實驗數據真實性與可靠性，也可以極大地節約測序成本。同時，流式細胞分選在篩選目的細胞的同時，還可以過濾懸液中的死細胞和碎片雜質等，減少樣本中無效細胞的比例，提高單細胞文庫構建的成功率以及后續的數據質量，讓單細胞測序更有深度與廣度。
吉凱基因在單細胞測序懸液制備中擁有20年臨床樣本處理經驗，能夠高標準制備各種疑難樣本的單細胞懸液，如鈣化血管樣本、腰椎間盤樣本、穿刺樣本等，并根據客戶需求成功進行多例樣本的特定類型細胞富集、稀有細胞富集、活細胞分選等，提供流式分選+單細胞測序一站式服務，化非特異為特異，為客戶的科研保駕護航。