編者按
未分化甲狀腺癌（Anaplastic Thyroid Carcinoma, ATC）是最惡性的內分泌系統腫瘤，中位生存期僅4.8個月，常規治療手段療效均極其有限，患者常死于局部腫瘤擴張引起的窒息或腫瘤遠處轉移。深入研究ATC細胞外基質信號異?；罨恼{控機制，對通過破壞腫瘤細胞賴以生存的“土壤”達到抗腫瘤作用的治療目的具有重要意義。
今天，我們特別回顧一項由浙江省人民醫院、浙江省內分泌腺體疾病診治研究重點實驗室葛明華教授團隊于2022年10月發表在《Molecular Cancer》的研究，通過建立小鼠和斑馬魚腫瘤移植模型，探討甲狀腺未分化癌 （ATC）的生長和轉移，表明CREB3L1通過激活細胞外基質（ECM）信號來維持ATC細胞的陽性癌癥相關成纖維細胞（CAF）樣特性，從而重塑腫瘤基質微環境并促進ATC的生長和轉移。
文章題目
CREB3L1 promotes tumor growth andmetastasis of anaplastic thyroid carcinoma byremodeling the tumor microenvironment
雜志：Molecular Cancer（IF=37.3）
發表時間：2022年10月5日
作者：潘宗富，徐通，包黎莎，譚卓，葛明華等
單位：浙江省內分泌腺體疾病診治研究重點實驗室、浙江省人民醫院等
01、研究背景
甲狀腺癌是最常見的惡性內分泌腫瘤，近年來其發病率逐漸增加。甲狀腺未分化癌 （ATC） 是一種罕見但極其惡性的甲狀腺癌亞型。根據美國癌癥聯合委員會（American Joint Committee on Cancer， AJCC）的腫瘤-淋巴結轉移（tumor-node-metastasis， TNM）分類系統，ATC患者通常分為IV期，中位生存時間僅為3-7個月。目前，尚無延長患者總生存期的有效療法。ATC 具有極快的增長速度，并且具有高度侵入性。超過40%的ATC患者有遠處轉移，常死于局部腫瘤擴大或遠處轉移引起的窒息。
細胞外基質（ECM）是腫瘤微環境的基本組成部分。ECM的生物學和機械變化深刻影響腫瘤的侵襲、轉移、免疫逃逸和耐藥性。在原發性腫瘤腫塊中，ECM以腫瘤允許的方式嚴格調節，這反過來又促進了腫瘤進展并影響癌細胞侵襲。通過與基質細胞相互作用，腫瘤細胞重塑ECM，促進共價分子間交聯和超分子聚集體（如纖維狀膠原蛋白）的大量沉積。幾種膠原蛋白亞型與甲狀腺癌的發生和發展密切相關。V型膠原在甲狀腺癌細胞的粘附、遷移和侵襲中起著重要作用。I型膠原在甲狀腺癌中上調，與其患者的生存率低有關。 ATC的一個已知特征是它能夠輕松塑造腫瘤基質微環境。與甲狀腺狀癌（PTC）組織相比，ATC組織中的膠原合成和細胞外基質重塑等生物過程受到過度刺激。鑒于ECM對ATC 的惡性表型具有至關重要的調節作用，迫切需要闡明ATC中ECM重塑的機制。
cAMP響應元件結合蛋白3（CREB3）家族成員位于內質網（ER）膜中，當被S1P和S2P蛋白酶切割時充當轉錄因子。在哺乳動物中，CREB3家族由五個成員組成，對蛋白質分泌、脂質代謝和生存至關重要。CREB3L1作為促甲狀腺激素的調節蛋白，因此，它控制甲狀腺組織中膠原蛋白分泌的誘導。CREB3L1異常表達被認為是上皮樣纖維肉瘤、乳腺癌和膀胱癌惡性進展的關鍵驅動因素。在之前的研究中，我們得出結論，CREB3L1是ATC中大多數膠原亞型基因的主要調節因子，這表明它可能調節ECM信號傳導。然而，CREB3L1在ATC進展中的確切作用和機制仍然難以捉摸。
在這個研究中，我們發現CREB3L1在間變性甲狀腺癌（ATC）的體內、體外，均對腫瘤的發生和轉移起到重要作用。它通過KPNA2易位進入細胞核，在那里激活ECM信號傳導，并塑造ATC腫瘤基質微環境。這些結果證實，CREB3L1重塑腫瘤間質微環境，并確定CREB3L1是促進ATC的關鍵驅動因素。
02、研究成果
1. CREB3L1在侵襲性甲狀腺癌中高表達，與預后不良相關
為了研究CREB3家族成員在甲狀腺癌中的作用，研究者整合并分析了來自四個數據集的 216個樣本（78個NT、69個PTC、17個PDTC、52個ATC）。結果顯示，ATC組織中只有CREB3L1顯著上調。CREB3L1水平隨著腫瘤分期的增加而增加，高CREB3L1表達的患者死亡風險更大。
根據單因素分析，CREB3L1表達升高（HR=4.831,95%置信區間[CI]：1.754-13.3，P=0.00231）的甲狀腺癌患者比CREB3L1表達降低的患者更容易死亡。此外，總生存期（OS）與T（P=0.00217）、M（P=0.03159）和TNM分期（P=0.0001331）、最大腫瘤直徑（P=0.0137）和新輔助治療史（P=0.0001871）之間的顯著相關性。
多因素Cox回歸分析表明，TNM分期和高CREB3L1表達均是甲狀腺癌患者準確的OS預測因子。在234 例甲狀腺癌組織的獨立樣本中對CREB3L1進行IHC染色顯示，CREB3L1的高表達與較短的無進展生存期顯著相關（P = 0.000229）。此外，在獨立組織樣本中，與PTC或NT相比，ATC中的CREB3L1增加，在甲狀腺癌細胞系中也觀察到類似的趨勢。
圖1. 甲狀腺癌中CREB3L1的表達及其臨床患病率
表1. CREB3L1表達與患者預后的單因素和多因素Cox回歸分析
2. CREB3L1是ECM中癌細胞侵襲所必需的
鑒于ATC具有快速生長速度和高度侵襲性行為的特點，研究者試圖確定CREB3L1的高表達是否是維持ATC侵襲性表型的原因。CREB3L1被敲低或過表達，具有很高的療效，如蛋白質印跡法所證實的那樣。CREB3L1的缺失或過表達對ATC和PTC細胞的增殖和遷移沒有明顯影響。然而，CREB3L1敲低顯著阻礙了ATC細胞的侵襲，而CREB3L1過表達促進了基質膠存在下的PTC細胞侵襲。
圖2. 在體外CREB3L1敲除抑制了ATC的入侵
3. 敲除CREB3L1顯著抑制了ATC細胞的腫瘤生長和轉移
為了可視化CREB3L1對體內ATC轉移的影響，采用了斑馬魚異種移植模型。CREB3L1敲除明顯降低了ATC細胞來源的異種移植物在5 dpf 斑馬魚上的轉移能力。
此外，為了評估CREB3L1表達對體內腫瘤生長的影響，將具有CREB3L1敲低的ATC細胞皮下注射到裸鼠體內。與對照組小鼠相比，攜帶CREB3L1敲低細胞來源的異種移植物小鼠的腫瘤體積顯著降低。
通過靜脈注射8505C細胞創建了ATC肺轉移小鼠模型。當CREB3L1在模型小鼠中被敲除時，8505C細胞轉移強度顯著降低。這些數據證實，CREB3L1是一種重要的調節劑，可維持ATC的惡性表型。
圖3.CREB3L1敲低可減少體內ATC的轉移和腫瘤生長
4. CREB3L1的高表達與ECM信號轉導的激活有關
為了描述CREB3L1驅動ATC攻擊性的機制，進行了GSEA分析。CREB3L1表達升高與ECM和膠原信號轉導的激活顯著相關。進一步使用來自四個數據集的216個樣本來確定 ECM 和膠原評分。與NT或其他甲狀腺癌亞型相比，ATC組織具有顯著激活的ECM和膠原信號傳導。
更重要的是，CREB3L1的表達與ECM和膠原信號的活性高度相關。免疫熒光染色顯示CREB3L1在正常組織和PTC組織中的表達較弱。PTC組織中浸潤的成纖維細胞很少，CREB3L1在FAP陽性成纖維細胞中不表達。相反，大量的FAP CREB3L1 CAF浸潤在ATC組織中。
此外，許多ATC癌細胞同時表達CREB3L1和成纖維細胞標志物FAP，表明ATC細胞具有CAF樣表型。進一步的研究證實，ATC細胞中CREB3L1的敲除顯著抑制了各種膠原亞型和合酶的表達，其中COL5A1的下調最為顯著。α-SMA的Masson三色染色和免疫組織化學染色證實，CREB3L1的缺失顯著減少ATC細胞來源的異種移植物中的膠原纖維和肌成纖維細胞。ATC細胞來源的異種移植物中敲除CREB3L1后COL5A1的含量也明顯下降。
圖4. CREB3L1與甲狀腺癌的ECM信號轉導有關
5. CREB3L1和ECM信號轉導的異常表達參與了ATC的演變
為了探究CREB3L1在維持ATC惡性表型中的作用，將兩個單細胞RNA測序數據集合并并進行了分析。經過質量控制，共獲130,226個細胞16個細胞亞群。CREB3L1在ATC-1和ATC-2亞群以及ATC衍生的成纖維細胞中高表達，但在PTC衍生的成纖維細胞和鄰近組織中表達較弱。
對上皮細胞的進一步分析表明，ATC腫瘤細胞中明顯存在CREB3L1，其具有極高的ECM和膠原信號轉導活性。軌跡分析顯示PTC或ATC細胞的不同分支與甲狀腺上皮濾泡細胞分化。值得注意的是，在ATC的進化過程中，CREB3L1的表達被顯著上調，伴隨著ECM和膠原信號轉導的活性明顯增加。這些結果表明，CREB3L1介導的ECM信號轉導對ATC的形成和生長至關重要。
圖5. 單細胞RNA測序揭示CREB3L1和下游ECM信號轉導在ATC生長中的作用
6. CREB3L1參與誘導α-SMA CAF的分化
癌細胞刺激基質祖細胞分化為CAF，它們的相互作用推動了ECM重塑，創造了一個支持腫瘤生長和轉移的癌癥生態位。鑒于CREB3L1與ECM信號傳導密切相關，研究者研究了CREB3L1是否參與塑造腫瘤基質微環境。
scRNA-seq 分析顯示，ATC-1和ATC-2亞群、成纖維細胞和肌成纖維細胞具有頻繁的細胞間相互作用。有趣的是，在8505C細胞中敲除CREB3L1并不影響球體的形成，而在CAF存在下，具有CREB3L1敲除的8505C衍生球體明顯小于對照組。這表明塑造CAFs需要CREB3L1來支持ATC細胞的生長。
此外，將8505C細胞和CAFs的混合物植入卵黃體外周空間，促進ATC細胞的轉移，而敲除8505C細胞中的CREB3L1則顯著減少了ATC細胞的轉移數量。流式細胞技術分析顯示，ATC細胞共培養產生α-SMA CAF，在8505C細胞中敲低CREB3L1后，CAF顯著減少。在由8505C和CAFs混合而成的球體中也發現了類似的結果。
我們注意到CREB3L1敲低ATC肺轉移小鼠組肺組織中α-SMA CAFs的比例顯著降低。大多數ATC轉移灶定植在離血管較遠的地方，并且經常與α-SMA成纖維細胞共存。相反，CREB3L1敲低減弱了ATC細胞的侵襲能力，其中大多數細胞以及少數α-SMA成纖維細胞定位于血管。
圖6.CREB3L1參與重塑ATC的基質微環境
7. CREB3L1促進IL-1α的產生，刺激α-SMACAFs分化
為了探索誘導ATC細胞分化α-SMA CAFs的確切信號，利用細胞因子陣列來分析來自8505C細胞的上清液或敲除CREB3L1后與CAFs共培養物細胞因子的變化。敲低CREB3L1后，8505C上清液中的8種細胞因子和8505C-CAFs共培養上清液中的7種細胞因子在1.2倍的閾值下降低。IL-1α在兩個實驗中都持續下調，因此被認為是候選細胞因子。ELISA結果證實，當與CAFs共培養時，IL-1α在敲低CREB3L1后下調。外源性IL-1α刺激在8505C細胞中不促進α-SMA CAF分化。
然而，同時敲除8505C細胞中的CREB3L1和IL-1α抑制了 α-SMA CAF 的降低。表明ATC細胞誘導CAF激活的復雜信號。盡管CREB3L1在S1P和S2P切割后被認為是轉錄因子，但CREB3L1介導的ECM激活機制仍然難以捉摸。核質分離和免疫熒光染色顯示ATC細胞中CREB3L1核易位升級。在分析CREB3L1的氨基酸序列時，發現位于氨基酸292和314之間的核定位序列。這表明轉運蛋白調節CREB3L1的核進入。因此，研究者篩選了核易位受體超家族的核蛋白成員的表達譜。結果顯示，與PTC和NT相比，ATC組織中的KPNA2水平顯著升高。
此外，co-IP結果顯示，KPNA2（而非importin）與CREB3L1形成復合物，在ATC細胞中的結合水平最高。研究者還發現，KPNA2敲低顯著抑制了CREB3L1的核易位，導致其CREB3L1保留在細胞質中。
總的來說，這些結果表明，KPNA2介導的CREB3L1核易位增強了ECM信號，從而驅動了ATC細胞的惡性表型。
圖7. KPNA2對CREB3L1的核易位激活IL-1α
03、編者點評
本研究中，CREB家族成員CREB3L1被確定為驅動ATC侵襲性的關鍵調控因子?；诙嘟M學和多種腫瘤模型的綜合分析，研究發現CREB3L1通過激活ECM信號和重塑腫瘤間質微環境，促進ATC腫瘤的生長和轉移。
軌跡分析表明，伴隨ECM信號的CREB3L1對ATC的進化至關重要。ATC細胞中CREB3L1的表達促進了il-1α介導的CAFs分化，從而重塑了腫瘤生態位。由CREB3L1維持的惡性表型與KPNA2介導的CREB3L1進入細胞核的運輸有關，該運輸激活了下游的ECM信號。CREB3L1是CREB3轉錄因子家族的一員，參與重要的生物過程，如代謝、分化和蛋白質分泌。當篩選CREB3家族的表達譜時，研究者發現與PTC和NT組織相比，ATC組織中CREB3L1特異上調，為ATC的發生發展機制以及最終確定潛在的治療靶點提供了重要的理論支持。
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