FITC-xtra 異硫氰酸熒光素具有與FITC幾乎相同光譜特性，溫和綴合條件下比FITC的綴合產(chǎn)率高。在相同條件下，F(xiàn)ITC-xtra抗體綴合物提供比FITC標(biāo)記的綴合物的信號(hào)/背景比高得多。
圖1.將HeLa細(xì)胞與帶有(Tubulin+)或不帶有(Tubulin-)的小鼠抗微管蛋白抗體以及生物素化的山羊抗小鼠IgG孵育，然后分別用FITC-Xtra鏈霉親和素偶聯(lián)物（綠色，左）或FITC-鏈霉親和素偶聯(lián)物（綠色，右）染色。細(xì)胞核用Hoechst 33342（藍(lán)色，Cat#17530）染色。
FITC-xtra 異硫氰酸熒光素適用范圍
用于標(biāo)記蛋白質(zhì)
FITC-xtra 異硫氰酸熒光素優(yōu)勢(shì)
1.光穩(wěn)定性好
2.熒光不受pH（4-10）影響
FITC-xtra 異硫氰酸熒光素實(shí)驗(yàn)方案
（該標(biāo)記方案適用山羊抗小鼠IgG與FITC-xtra的偶聯(lián)物）
準(zhǔn)備蛋白質(zhì)儲(chǔ)備溶液（溶液A）
將100μL反應(yīng)緩沖液（例如，1M碳酸鈉溶液或pH~9.0的1M磷酸鹽緩沖液，）與900μL目標(biāo)蛋白溶液（例如抗體，蛋白質(zhì)濃度> 2 mg / ml）混合，得到1 mL蛋白標(biāo)記儲(chǔ)備液。
注：1.蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的pH值應(yīng)為8.5±0.5。如果蛋白質(zhì)溶液的pH低于8.0，則使用1M碳酸氫鈉溶液或1M pH 9.0磷酸鹽緩沖液，將pH調(diào)節(jié)至8.0-9.0的范圍。
2.應(yīng)將蛋白質(zhì)溶于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中。如果蛋白質(zhì)溶解在Tris或甘氨酸緩沖液中，則必須用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去用于蛋白質(zhì)沉淀的游離胺或銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）。
3.不純的抗體、牛血清蛋白（BSA）和明膠穩(wěn)定的抗體不能很好的被標(biāo)記。疊氮化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應(yīng)。通過透析或旋轉(zhuǎn)柱除去疊氮化鈉或硫柳汞，以獲得標(biāo)記結(jié)果。
4.如果蛋白質(zhì)濃度小于2mg / mL，偶聯(lián)效率明顯降低。為獲得好的標(biāo)記效率，建議蛋白質(zhì)濃度范圍為2-10 mg / mL。
準(zhǔn)備染料儲(chǔ)備溶液（溶液B）
將無水DMSO加入到FITC-xtra小瓶中以制備10-20mM儲(chǔ)備溶液，通過移液或渦旋混合均勻。
注：在開始綴合之前準(zhǔn)備染料儲(chǔ)備溶液（溶液B）隨配隨用，保證使用的溶液的新鮮。染料儲(chǔ)備溶液的長(zhǎng)期儲(chǔ)存可降低染料活性。溶液B可以在不受光照和潮濕的情況下儲(chǔ)存在冰箱中兩周。
準(zhǔn)備所需的蛋白質(zhì)綴合物
注：每種蛋白質(zhì)都需要不同的染料/蛋白質(zhì)比例，這也取決于染料的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的過度標(biāo)記可能對(duì)其結(jié)合親和力產(chǎn)生不利影響，而低染料/蛋白質(zhì)比率的蛋白質(zhì)綴合物會(huì)降低靈敏度。我們建議您通過使用連續(xù)不同量的標(biāo)記染料溶液重復(fù)步驟4和5來實(shí)驗(yàn)確定染料/蛋白質(zhì)比率。通常，對(duì)于大多數(shù)染料 - 蛋白質(zhì)綴合物，推薦使用4-6種染料/蛋白質(zhì)。
1.使用10：1摩爾比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）作為起始點(diǎn)：將5μl染料儲(chǔ)備溶液（溶液B，假設(shè)染料儲(chǔ)備溶液為10 mM）加入到蛋白質(zhì)的小瓶中溶液（95μl溶液A），有效搖動(dòng)。假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為10mg / mL并且蛋白質(zhì)的分子量為~200KD，蛋白質(zhì)的濃度為~0.05mM。
注意：蛋白質(zhì)溶液中DMSO的濃度應(yīng)<10％。
2.進(jìn)行綴合反應(yīng)。在有效搖動(dòng)下將適量的染料儲(chǔ)備溶液（溶液B）加入到蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的小瓶中。繼續(xù)在室溫下旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)反應(yīng)混合物30-60分鐘。
3.重復(fù)＃3.2，溶液B /溶液A的摩爾比為5：1; 如果需要，分別為15：1和20：1。
4.使用預(yù)制的旋轉(zhuǎn)柱或其他技術(shù)純化所需的綴合物。
5.計(jì)算上述4種綴合物的染料/蛋白質(zhì)比（DOS）。