FITC-xtra 異硫氰酸熒光素具有與FITC幾乎相同光譜特性，溫和綴合條件下比FITC的綴合產率高。在相同條件下，FITC-xtra抗體綴合物提供比FITC標記的綴合物的信號/背景比高得多。

圖1.將HeLa細胞與帶有(Tubulin+)或不帶有(Tubulin-)的小鼠抗微管蛋白抗體以及生物素化的山羊抗小鼠IgG孵育，然后分別用FITC-Xtra鏈霉親和素偶聯物（綠色，左）或FITC-鏈霉親和素偶聯物（綠色，右）染色。細胞核用Hoechst 33342（藍色，Cat#17530）染色。

FITC-xtra 異硫氰酸熒光素適用范圍

用于標記蛋白質

FITC-xtra 異硫氰酸熒光素優勢

1.光穩定性好

2.熒光不受pH（4-10）影響

FITC-xtra 異硫氰酸熒光素實驗方案

（該標記方案適用山羊抗小鼠IgG與FITC-xtra的偶聯物）

準備蛋白質儲備溶液（溶液A）

將100μL反應緩沖液（例如，1M碳酸鈉溶液或pH~9.0的1M磷酸鹽緩沖液，）與900μL目標蛋白溶液（例如抗體，蛋白質濃度> 2 mg / ml）混合，得到1 mL蛋白標記儲備液。 

注：1.蛋白質溶液（溶液A）的pH值應為8.5±0.5。如果蛋白質溶液的pH低于8.0，則使用1M碳酸氫鈉溶液或1M pH 9.0磷酸鹽緩沖液，將pH調節至8.0-9.0的范圍。 

       2.應將蛋白質溶于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中。如果蛋白質溶解在Tris或甘氨酸緩沖液中，則必須用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去用于蛋白質沉淀的游離胺或銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）。 
       3.不純的抗體、牛血清蛋白（BSA）和明膠穩定的抗體不能很好的被標記。疊氮化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應。通過透析或旋轉柱除去疊氮化鈉或硫柳汞，以獲得標記結果。 
       4.如果蛋白質濃度小于2mg / mL，偶聯效率明顯降低。為獲得好的標記效率，建議蛋白質濃度范圍為2-10 mg / mL。

準備染料儲備溶液（溶液B）

將無水DMSO加入到FITC-xtra小瓶中以制備10-20mM儲備溶液，通過移液或渦旋混合均勻。 

注：在開始綴合之前準備染料儲備溶液（溶液B）隨配隨用，保證使用的溶液的新鮮。染料儲備溶液的長期儲存可降低染料活性。溶液B可以在不受光照和潮濕的情況下儲存在冰箱中兩周。

準備所需的蛋白質綴合物 

注：每種蛋白質都需要不同的染料/蛋白質比例，這也取決于染料的性質。蛋白質的過度標記可能對其結合親和力產生不利影響，而低染料/蛋白質比率的蛋白質綴合物會降低靈敏度。我們建議您通過使用連續不同量的標記染料溶液重復步驟4和5來實驗確定染料/蛋白質比率。通常，對于大多數染料 - 蛋白質綴合物，推薦使用4-6種染料/蛋白質。

1.使用10：1摩爾比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質）作為起始點：將5μl染料儲備溶液（溶液B，假設染料儲備溶液為10 mM）加入到蛋白質的小瓶中溶液（95μl溶液A），有效搖動。假設蛋白質濃度為10mg / mL并且蛋白質的分子量為~200KD，蛋白質的濃度為~0.05mM。 
注意：蛋白質溶液中DMSO的濃度應<10％。

2.進行綴合反應。在有效搖動下將適量的染料儲備溶液（溶液B）加入到蛋白質溶液（溶液A）的小瓶中。繼續在室溫下旋轉或搖動反應混合物30-60分鐘。

3.重復＃3.2，溶液B /溶液A的摩爾比為5：1; 如果需要，分別為15：1和20：1。

4.使用預制的旋轉柱或其他技術純化所需的綴合物。

5.計算上述4種綴合物的染料/蛋白質比（DOS）。