當前，環境污染已成為全球性的重大問題，環境污染物對人類健康和環境生態的影響備受關注。在環境污染物研究中，毒性評價是評估污染物風險的重要手段。
斑馬魚胚胎急性毒性評價作為一種常用的生態毒性評估方法，其快速、敏感、有效，通過將斑馬魚胚胎暴露于不同濃度的測試物質中，并觀察和記錄胚胎的存活率、發育異常和其他毒性效應等，從而評估不同有機污染物（如多環芳烴、農藥等）、重金屬污染物（如鉛、汞、鎘等）及新型污染物對胚胎的毒性效應，有機污染物的暴露可導致胚胎生長發育遲緩、畸形率增加等毒性效應，評價化學物質對斑馬魚胚胎發育的潛在影響，被廣泛應用于環境監測、化學物質毒性作用機理研究、有毒物質拮抗劑的篩選、化學品安全性評價和生態風險評估等領域。
本文將對胚胎急性毒性評價方案及其在環境污染物中的應用進行概述，以期為環境污染物的風險評估和控制提供科學依據。
01、斑馬魚胚胎急毒性評價優勢
基于斑馬魚胚胎對外界毒性物質的敏感性、其發育過程的透明性等特性，斑馬魚胚胎急性毒性評價通過將斑馬魚胚胎暴露于不同濃度的環境污染物中，觀察其存活率、生長發育、畸形率等生物學指標的變化，從而評估污染物對斑馬魚胚胎的毒性效應，并預測其可能對人類健康和環境生態產生的影響。
這種評價方法具有快速、敏感、準確和可靠的特點，因此，在環境污染物風險評估、環境監測及藥物安全性評價等領域得到了廣泛應用。
與人類高達87%的基因同源性
斑馬魚的基因組與人類有高達87%的相似度，且其毒性特征和信號傳導通路與人類近似，使斑馬魚胚胎急性毒性評價的結果可以較好地反映化合物對人類可能產生的毒性效應；
對環境污染物非常敏感
斑馬魚胚胎對環境中的污染物非常敏感，當暴露于有毒物質時，其存活率、生長發育和形態學特征會發生變化，這些變化可以直接或間接地反映出污染物的毒性；
胚胎透明，便于觀察
斑馬魚胚胎在體外發育，其通體透明，使研究人員可以在顯微鏡下實時觀察和記錄胚胎暴露于污染物后的各種生物學反應，直接觀察胚胎的發育情況，從而評估污染物的毒性。胚胎及幼魚通體透明，顯微鏡下可直接觀察多種組織器官變化，實驗結果直觀易懂；
高通量高可靠
作為適用微孔板高通量篩選的脊椎動物，斑馬魚胚胎體積小，易于在實驗室條件下進行大規模的培養和實驗。通過進行斑馬魚胚胎高通量篩選，可以在短時間內對大量樣品進行毒性評價，且樣本數量大、個體差異小，結果更可靠，可以大大提高實驗效率。
02、斑馬魚胚胎急毒性評價方案
近年來，斑馬魚胚胎急性毒性評價在環境污染物評價中發揮了重要作用，通過將斑馬魚胚胎暴露于不同濃度的污染物中，觀察并記錄胚胎的存活率、畸形率、孵化率以及發育過程中的各種生物學變化，可以評估污染物對斑馬魚胚胎的毒性效應，并預測其可能對人類健康和環境生態產生的影響。
實驗原理
斑馬魚在24 hpf身體基本成形，在2-3 dpf時，胚胎已經孵化；22 hpf開始心跳，48 hpf完成心血管系統發育，在2 dpf時，斑馬魚心臟處于比較敏感階段，因此比較適合用于研究心血管毒性；
3 dpf的斑馬魚肝臟結構和功能發育完全，在肝細胞組成、功能、信號轉導、對損傷的反應以及介導肝臟疾病的細胞過程等方面與人類肝臟相似；胚胎和成年斑馬魚的腎臟解剖結構的分子特征揭示了細胞組成和腎單元段模式與人的總體保守性；
斑馬魚的視覺系統與包括人類在內的其他脊椎動物非常相似，例如其視網膜和晶狀體的形態和結構，以及其在5 dpf就具有視覺功能；36 hpf斑馬魚胃腸道開始發育，3 dpf時開始收縮，4 dpf斑馬魚腸道中已經出現微生物，同時胰臟等消化器官與斑馬魚腸道同步發育，5 dpf消化系統基本發揮功能。
斑馬魚體外受精和發育可以同時觀察到顱面區、大腦、眼睛、心臟、肝臟、胃腸道、脊索、軀干、卵黃囊吸收、水腫、色素沉著、循環系統等大量毒理學終點，從而提供了理想的模型。
參考OECD 236斑馬魚急性毒性方法，在斑馬魚受精卵開始處理，可以客觀的評價樣品對于各個器官的毒性情況。
實驗周期：4周
斑馬魚品系：野生型AB品系
給藥周期：受精后1-1.5 h（4-16細胞期）-5dpf
評價指標
1、實驗一：樣品最大非致死濃度（MNLC）和10%致死濃度（LC10）確定
實驗組別：共16組，共3個樣品，正常對照組、每個樣品5個檢測濃度。
實驗方法：樣品處理結束后，進行表型觀察。
評價指標：
實驗組斑馬魚死亡數量，用Origin 8.0統計學軟件繪制最佳的“濃度-死亡率”效應曲線，并計算樣品對斑馬魚的MNLC和LC10。
實驗周期：2周
2、實驗二：樣品胚胎急性毒性評價
實驗組別：
共13組，共3個樣品，正常對照組、每個樣品4個檢測濃度（常規為1/9MNLC、1/3MNLC和MNLC和LC10，或由委托方選擇）。
實驗方法：
隨機選取4-16細胞期野生型AB品系斑馬魚于6孔板中，每孔（實驗組）均處理30尾斑馬魚。每孔容量為3 mL。
①28 ℃處理至24 hpf時，每個實驗組拍攝視頻，分析斑馬魚自發運動；
②處理至48 hpf時，每個實驗組在解剖顯微鏡下觀察：卵凝結、體節形成異常、尾部延伸停止和無心跳，并統計發生率；
③處理至48 hpf時，每個實驗組在解剖顯微鏡下觀察并統計斑馬魚心率；
④處理至72 hpf時，每個實驗組在解剖顯微鏡下觀察并統計斑馬魚孵化率；
⑤處理至120 hpf時，每個實驗組在解剖顯微鏡下觀察并記錄斑馬魚心臟、循環系統、出血及血栓、腦、下頜、眼睛、肝臟、腎、腸道、軀干/尾/脊索、肌肉/體節、身體著色、體長等反應情況，采集典型毒性器官照片并。統計毒性發生率并鑒別毒性靶器官；
⑥處理至120 hpf時，每個實驗組隨機選取10尾斑馬魚在解剖顯微鏡下拍照，分析斑馬魚體長；
⑦處理至120 hpf時，每個實驗組隨機選取10尾斑馬魚置于行為分析儀下，分析斑馬魚總運動距離，評價樣品對運動功能的影響。
評價指標：
①胎動頻次；
②卵凝結、體節形成異常、尾部延伸停止和無心跳發生率；
③心率；
④孵化率；
⑤評價指標：心臟（心包水腫、心律異常）、循環系統（血流加快、血流減慢/缺失）、出血和血栓、腦（腦變小、腦變性）、下頜（畸形）、眼（變?。⒏闻K（增大、縮小/缺失、變性）、卵黃囊（吸收延遲）、腎（腎性水腫）、腸道（異常）、軀干/尾/脊索（彎曲、水腫）、肌肉/體節（變性）、魚鰭（缺失）、體長（變短）、行為（異常）、身體著色（異常）、耳（變?。?、鰾（缺失），并統計毒性發生率；
⑥體長；
⑦總運動距離
實驗周期：2周
結果展示方式
（1）MNLC和LC10：提供“濃度-死亡率”效應曲線
圖1. 斑馬魚“濃度-死亡率”效應曲線
（2）毒性表型評價：提供表型圖
圖2. 斑馬魚胚胎急性毒性表型圖（注：B=腦；H=心臟；J=下頜；In=腸道；L=肝臟；Y=卵黃囊；E=眼睛）
圖3. 斑馬魚早期發育階段的致死指標代表圖。A：卵凝結；B：心包水腫（*），←所指為體節；C：尾部未分離（←）和眼芽缺失（*）。圖片來自OECD 236（2013）。
圖4. 斑馬魚肝臟局部圖。A圖為正常斑馬魚，B圖斑馬魚出現肝臟發黑（變性）和卵黃囊吸收延遲。綠色虛線所示為肝臟，紅色虛線所示為卵黃囊。
圖5. 斑馬魚肌肉變性典型圖。A圖為正常斑馬魚，B圖斑馬魚出現肌肉變性（肌肉紋理不清晰、表面不平整、顏色偏暗）。
圖6. 斑馬魚下頜畸形典型圖。（A圖為正常斑馬魚，B圖斑馬魚出現下頜畸形（下頜發育延遲，不能與上頜咬合）
圖7. 斑馬魚色素異常典型圖和魚鰾缺失典型圖。A圖為正常斑馬魚，B圖斑馬魚色素異常（紅色箭頭）和魚鰾缺失（綠色箭頭標記）。
圖8. 斑馬魚眼睛變小，心包水腫，肝變性，腸道異常典型圖。A圖為正常斑馬魚，B圖斑馬魚眼睛變小（藍色箭頭）、心包水腫（紅色虛線）、肝變性（黃色虛線）和腸道異常（綠色虛線）。
圖9. 斑馬魚腎性水腫典型圖。A圖為正常斑馬魚，B圖腎性水腫（紅色箭頭）。
圖10. 斑馬魚身體彎曲典型圖。A圖為正常斑馬魚，B圖身體彎曲（紅色箭頭）。
圖11. 斑馬魚體長變短和心包水腫典型圖。A圖為正常斑馬魚，B圖體長變短和心包水腫（紅色虛線）。
圖12. 斑馬魚出血典型圖。A圖為正常斑馬魚，B圖出血（紅色箭頭）。
圖13. 運動軌跡典型圖（注：黑色線為慢速運動距離、綠色線為中速運動距離、紅色線為快速運動距離）
圖14. 總運動距離，與正常對照組相比，***p < 0.001
近年來，斑馬魚作為一種重要模式生物，在環境毒理評價領域的應用日益廣泛。環特生物依托于斑馬魚+哺乳動物+類器官+基因編輯4大技術平臺，基于過去10余年持續的技術創新實踐，以專業、前沿的技術服務解決方案，助力環境毒理學研究與突破！
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