CRISPR/Cas9技術是近十年最熱門的基因編輯工具，基于此發展的CRISPR 文庫篩選是一種大規模的功能基因篩選方法，旨在尋找大海中的幾根針。CRISPR篩選有助于發現引發細胞類型特定功能或表型差異的關鍵基因。
CRISPR-KO文庫篩選的基本思想是：基于sgRNA引導Cas9至目標位點切割DNA雙鏈，引發非同源修復機制，實現基因的敲除。KO庫針對人的兩萬余個編碼基因及千余個miRNA，每個基因設計6個靶點，進行病毒的混合包裝，最終產生含有十二萬個不同sgRNA序列的混合病毒。隨后將病毒感染細胞，在培養皿中敲除每個可能重要的基因，每個細胞中敲除具有不同基因的細胞群。一部分細胞死亡，一部分存活，甚至生長得更好并成為主要的細胞類型，對存活下的細胞群進行基因組NGS測試，以確定哪些序列存在或哪些序列耗盡，最終鎖定關鍵基因。這樣的實驗可以確定在一定條件下生存所必需的基因，例如腫瘤增殖關鍵基因1，藥靶增敏基因2。
最常見的CRISPR 篩選基于對存活的細胞進行測序，以找出關鍵因子，這種可以稱為陽性篩選。但如果要尋找負性功能的基因，例如對藥物敏感基因，由于基因敲除之后，在藥物篩選下，細胞死亡，則無法提取其基因組進行靶標分析，那如何確立關鍵呢？
由于sgRNA序列在設計文庫時就確認，既然無法正向從存活細胞中獲取靶標，則可以反向確認，即尋找出損耗的sgRNA。ADLI3等人運用CRISPR 篩選，尋找在治療胰腺導管腺癌中對曲美替尼敏感性基因，作者構建了針對約 4000 個富含表觀遺傳調節因子、轉錄因子和核蛋白基因的sgRNA，以0.3xMOI感染了1.5~2億個細胞，經過曲美替尼的一周篩選，將存活的細胞分成9批，每批約800萬個細胞，一部分細胞移植小鼠體內，并以藥物篩選；一部分細胞直接在體外培養，隨后兩種類型被收集用于NGS測序。
sgRNA測序分析可以得出存活細胞的sgRNA，并計算出損耗的sgRNA數量，對前2000 個富集和耗盡的sgRNA進行聚類分析以及GO分析，發現細胞粘附和遷移中起關鍵作用的基因，如IL8、鈣粘蛋白FZR1和轉移相關的EGFL6是體內篩選中發現的最枯竭的基因之一，表明這些基因的存在對腫瘤的發生至關重要。曲美替尼治療的腫瘤中耗盡的sgRNA靶標為有絲分裂細胞周期和動粒功能，例如CENPE、NUF2、MIS12和CENPI以及核糖核苷酸還原酶的催化亞基RRM1。
本文進行的體內、體外的篩選對比，我們先不做論述，由于大部分學者是基于細胞水平的靶標篩選，因此，我們抽提上述實驗關于陰性篩選的核心點：
足量的sgRNA覆蓋度：常用陽性篩選細胞數為百萬至千萬級別，本文作者使用了約2億個細胞，最終獲取了單組800萬個細胞，考慮到sgRNA數量為4萬，因此理論的單個sgRNA覆蓋度是200x。足量的sgRNA覆蓋對于陰性篩選是必要的，可以減少文庫構建及包裝過程中靶標丟失造成的實驗誤差，最終可通過單個基因總sgRNA丟失率得出基因重要性（如A基因設計了10個靶點，假設未丟失一個sgRNA的情況下，理論測得次數為200x10=2000次；而B基因的10個靶點總測得次數為100，則得出B基因95%的sgRNA損耗了，也就是細胞死亡了）；
因此，負性篩選要多一步損耗sgRNA的計算，從損耗的sgRNA推測出關鍵基因。吉凱基因與張峰實驗室達成合作，含有張峰實驗室全套的人、小鼠全基因組KO、SAM激活文庫，可對全基因組的基因掃描，幫助研究人員找到關鍵因子，感興趣的，快來咨詢吧?。?/span>
【文庫病毒使用常見問題】
1. 文庫病毒如何確保sgRNA的有效性？
從設計層面，只能保證sgRNA的特異性，單其能否有效引導Cas9蛋白至目標位點切割是未知的，因此常規針對同個基因設計多個靶點，只要一個靶點有效，則能達到基因敲除的目的，如張鋒文庫針對同個基因設計六個靶點，上述定制文庫設計了近十個靶點，因此文庫靶點不注重單個靶點是否有效。
2. 如何保證文庫的sgRNA完整性？
文庫定制完成之后，在病毒包裝之前，對抽提的質粒進行NGS測序，保證低于2%的sgRNA丟失率。此2%平均到每個基因上，大約每個基因丟失0.12個sgRNA，遠低于每個基因6個sgRNA的數值。從概率上講，單個基因丟失大于三個sgRNA的概率是極低的，即便文庫完整性再下降10%，單個基因也有足量的靶點行使KO。
3. 如何控制進入細胞的病毒數？
文庫旨在尋找關鍵性基因，多為篩選單個功能基因，因此需要盡可能控制單個病毒進入單個細胞，因此文庫病毒是以0.3至0.6的MOI感染細胞，不尋求高感染效率?？紤]到進入細胞sgRNA的不確定性（如），多些分組，可以排除
4. 如何檢測存活細胞的sgRNA？
與已知sgRNA的基因敲除不同，由于存活細胞的sgRNA是未知的，也不清楚哪些基因發生敲除，因此針對目的基因設計檢測引物是行不通的。文庫的檢測是對存活細胞基因組中的sgRNA進行檢測，引物本身設計在病毒骨架上，是通用型的。根據測得的sgRNA序列，跟底庫列表比對得出靶基因。
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