CRISPR/Cas9技術(shù)是近十年最熱門的基因編輯工具，基于此發(fā)展的CRISPR 文庫篩選是一種大規(guī)模的功能基因篩選方法，旨在尋找大海中的幾根針。CRISPR篩選有助于發(fā)現(xiàn)引發(fā)細(xì)胞類型特定功能或表型差異的關(guān)鍵基因。
CRISPR-KO文庫篩選的基本思想是：基于sgRNA引導(dǎo)Cas9至目標(biāo)位點(diǎn)切割DNA雙鏈，引發(fā)非同源修復(fù)機(jī)制，實(shí)現(xiàn)基因的敲除。KO庫針對人的兩萬余個(gè)編碼基因及千余個(gè)miRNA，每個(gè)基因設(shè)計(jì)6個(gè)靶點(diǎn)，進(jìn)行病毒的混合包裝，最終產(chǎn)生含有十二萬個(gè)不同sgRNA序列的混合病毒。隨后將病毒感染細(xì)胞，在培養(yǎng)皿中敲除每個(gè)可能重要的基因，每個(gè)細(xì)胞中敲除具有不同基因的細(xì)胞群。一部分細(xì)胞死亡，一部分存活，甚至生長得更好并成為主要的細(xì)胞類型，對存活下的細(xì)胞群進(jìn)行基因組NGS測試，以確定哪些序列存在或哪些序列耗盡，最終鎖定關(guān)鍵基因。這樣的實(shí)驗(yàn)可以確定在一定條件下生存所必需的基因，例如腫瘤增殖關(guān)鍵基因1，藥靶增敏基因2。
最常見的CRISPR 篩選基于對存活的細(xì)胞進(jìn)行測序，以找出關(guān)鍵因子，這種可以稱為陽性篩選。但如果要尋找負(fù)性功能的基因，例如對藥物敏感基因，由于基因敲除之后，在藥物篩選下，細(xì)胞死亡，則無法提取其基因組進(jìn)行靶標(biāo)分析，那如何確立關(guān)鍵呢？
由于sgRNA序列在設(shè)計(jì)文庫時(shí)就確認(rèn)，既然無法正向從存活細(xì)胞中獲取靶標(biāo)，則可以反向確認(rèn)，即尋找出損耗的sgRNA。ADLI3等人運(yùn)用CRISPR 篩選，尋找在治療胰腺導(dǎo)管腺癌中對曲美替尼敏感性基因，作者構(gòu)建了針對約 4000 個(gè)富含表觀遺傳調(diào)節(jié)因子、轉(zhuǎn)錄因子和核蛋白基因的sgRNA，以0.3xMOI感染了1.5~2億個(gè)細(xì)胞，經(jīng)過曲美替尼的一周篩選，將存活的細(xì)胞分成9批，每批約800萬個(gè)細(xì)胞，一部分細(xì)胞移植小鼠體內(nèi)，并以藥物篩選；一部分細(xì)胞直接在體外培養(yǎng)，隨后兩種類型被收集用于NGS測序。
sgRNA測序分析可以得出存活細(xì)胞的sgRNA，并計(jì)算出損耗的sgRNA數(shù)量，對前2000 個(gè)富集和耗盡的sgRNA進(jìn)行聚類分析以及GO分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞粘附和遷移中起關(guān)鍵作用的基因，如IL8、鈣粘蛋白FZR1和轉(zhuǎn)移相關(guān)的EGFL6是體內(nèi)篩選中發(fā)現(xiàn)的最枯竭的基因之一，表明這些基因的存在對腫瘤的發(fā)生至關(guān)重要。曲美替尼治療的腫瘤中耗盡的sgRNA靶標(biāo)為有絲分裂細(xì)胞周期和動粒功能，例如CENPE、NUF2、MIS12和CENPI以及核糖核苷酸還原酶的催化亞基RRM1。
本文進(jìn)行的體內(nèi)、體外的篩選對比，我們先不做論述，由于大部分學(xué)者是基于細(xì)胞水平的靶標(biāo)篩選，因此，我們抽提上述實(shí)驗(yàn)關(guān)于陰性篩選的核心點(diǎn)：
足量的sgRNA覆蓋度：常用陽性篩選細(xì)胞數(shù)為百萬至千萬級別，本文作者使用了約2億個(gè)細(xì)胞，最終獲取了單組800萬個(gè)細(xì)胞，考慮到sgRNA數(shù)量為4萬，因此理論的單個(gè)sgRNA覆蓋度是200x。足量的sgRNA覆蓋對于陰性篩選是必要的，可以減少文庫構(gòu)建及包裝過程中靶標(biāo)丟失造成的實(shí)驗(yàn)誤差，最終可通過單個(gè)基因總sgRNA丟失率得出基因重要性（如A基因設(shè)計(jì)了10個(gè)靶點(diǎn)，假設(shè)未丟失一個(gè)sgRNA的情況下，理論測得次數(shù)為200x10=2000次；而B基因的10個(gè)靶點(diǎn)總測得次數(shù)為100，則得出B基因95%的sgRNA損耗了，也就是細(xì)胞死亡了）；
因此，負(fù)性篩選要多一步損耗sgRNA的計(jì)算，從損耗的sgRNA推測出關(guān)鍵基因。吉凱基因與張峰實(shí)驗(yàn)室達(dá)成合作，含有張峰實(shí)驗(yàn)室全套的人、小鼠全基因組KO、SAM激活文庫，可對全基因組的基因掃描，幫助研究人員找到關(guān)鍵因子，感興趣的，快來咨詢吧！！
【文庫病毒使用常見問題】
1. 文庫病毒如何確保sgRNA的有效性？
從設(shè)計(jì)層面，只能保證sgRNA的特異性，單其能否有效引導(dǎo)Cas9蛋白至目標(biāo)位點(diǎn)切割是未知的，因此常規(guī)針對同個(gè)基因設(shè)計(jì)多個(gè)靶點(diǎn)，只要一個(gè)靶點(diǎn)有效，則能達(dá)到基因敲除的目的，如張鋒文庫針對同個(gè)基因設(shè)計(jì)六個(gè)靶點(diǎn)，上述定制文庫設(shè)計(jì)了近十個(gè)靶點(diǎn)，因此文庫靶點(diǎn)不注重單個(gè)靶點(diǎn)是否有效。
2. 如何保證文庫的sgRNA完整性？
文庫定制完成之后，在病毒包裝之前，對抽提的質(zhì)粒進(jìn)行NGS測序，保證低于2%的sgRNA丟失率。此2%平均到每個(gè)基因上，大約每個(gè)基因丟失0.12個(gè)sgRNA，遠(yuǎn)低于每個(gè)基因6個(gè)sgRNA的數(shù)值。從概率上講，單個(gè)基因丟失大于三個(gè)sgRNA的概率是極低的，即便文庫完整性再下降10%，單個(gè)基因也有足量的靶點(diǎn)行使KO。
3. 如何控制進(jìn)入細(xì)胞的病毒數(shù)？
文庫旨在尋找關(guān)鍵性基因，多為篩選單個(gè)功能基因，因此需要盡可能控制單個(gè)病毒進(jìn)入單個(gè)細(xì)胞，因此文庫病毒是以0.3至0.6的MOI感染細(xì)胞，不尋求高感染效率。考慮到進(jìn)入細(xì)胞sgRNA的不確定性（如），多些分組，可以排除
4. 如何檢測存活細(xì)胞的sgRNA？
與已知sgRNA的基因敲除不同，由于存活細(xì)胞的sgRNA是未知的，也不清楚哪些基因發(fā)生敲除，因此針對目的基因設(shè)計(jì)檢測引物是行不通的。文庫的檢測是對存活細(xì)胞基因組中的sgRNA進(jìn)行檢測，引物本身設(shè)計(jì)在病毒骨架上，是通用型的。根據(jù)測得的sgRNA序列，跟底庫列表比對得出靶基因。
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