近期，廣州醫科大附屬第三醫院和美國得克薩斯大學西南醫學中心合作，利用基于質譜的蛋白質組學鑒定了參與鐵死亡的一個關鍵膜蛋白HPCAL1，并深入研究了其作用機制及潛在的靶向治療可能性。研究成果以“Identification of HPCAL1 as a specific autophagy receptor involved in ferroptosis”為題，發表在Autophagy（IF：13.391）上。
研究結果
?1.?HPCAL1?對鐵死亡是必須的
鐵死亡表現為細胞器和細胞膜的脂質過氧化，但關鍵的膜調控蛋白仍然未知。研究者使用鐵死亡激活劑RSL3（一種谷胱甘肽過氧化物酶 4 (GPX4) 的抑制劑，誘導鐵死亡）分別處理人纖維肉瘤細胞HT-1080和人非小細胞肺癌細胞Calu-1，隨后分離細胞膜組分并進行基于質譜的蛋白質組學檢測，以期尋找關鍵的鐵死亡膜調控蛋白。
細胞膜組分的蛋白質組學共鑒定了752個膜蛋白，這些膜蛋白的通路富集分析顯示，三羧酸循環代謝是鐵死亡中最受影響的通路，與此前報道的線粒體三羧酸循環和脂質代謝參與鐵死亡的報道相一致。
在鐵死亡激活劑RSL3處理后的HT-1080和Calu-1中有16個共有上調蛋白，包括MAGOH、SPTAN1、OSTM1、HPCAL1、CPT2、FKBP1A、EBNA1BP2、FBL、PRDX3、H1-3/HIST1H1D、ZYX、 UBE2M、ANXA7、EIF4G1、HNRNPUL1和PRKAR1A。隨后，研究者在兩輪實驗中分別使用靶向這些16個蛋白基因的siRNA處理HT-1080和Calu-1細胞，最終僅有HPCAL1 siRNA能同時降低RSL3誘導的細胞死亡。因此，研究者鎖定HPCAL1進行后續探索。
為了進一步確認HPCAL1在促進鐵死亡中的作用，研究者構建了能穩定敲低HPCAL1的兩個特異性shRNA。與HPCAL1 siRNA實驗結果一致，HPCAL1 shRNA抑制了RSL3或erastin（另一種鐵死亡誘導劑）誘導的HT-1080和Calu-1細胞生長抑制。
隨后的研究也表明，HPCAL1缺失不影響細胞膜的完整性。此外，HPCAL1缺失將顯著降低脂質過氧化，因此HPCAL1可能是鐵死亡中脂質過氧化的正調節劑。研究者繼續使用其他鐵死亡誘導劑，包括ML162、ML210、FIN56、FINO2和sulfasalazine處理HT-1080和Calu-1細胞，結果均證實了HPCAL1的促鐵死亡作用。而形成鮮明對比的是，細胞凋亡誘導劑staurosporine (STS)導致的細胞死亡并不受到HPCAL1敲低的影響。這一結果表明，HPCAL1是選擇性促進鐵死亡而非細胞凋亡。
研究者隨后對HPCAL1進行過表達，過表達后細胞對鐵死亡誘導劑RSL3或erastin的處理更加敏感。此外，在HPCAL1敲低的細胞中重新穩定過表達HPCAL1后，細胞恢復了對RSL3或erastin處理的敏感性,這種作用會被鐵死亡抑制劑liproxstatin-1抑制，而不受細胞凋亡抑制劑Z-VAD-FMK的影響。
HPCAL1最開始是在視網膜和腦組織中被檢測到的，而該蛋白其實廣泛表達于各種組織和細胞中。研究者在其他種類的人癌細胞系中使用shRNA敲低HPCAL1，結果顯示HPCAL1敲低均可以抑制RSL3或erastin誘導的細胞死亡。綜合以上研究表明，HPCAL1介導廣泛的鐵死亡。
?2.?HPCAL1介導的CDH2抑制能促進鐵死亡
研究者進一步探索了HPCAL1促進鐵死亡的作用機制。首先，研究者通過實驗排除了鈣離子參與HPCAL1介導的鐵死亡以及HPCAL1在鐵死亡中催化脂質通透性/氧化。隨后，研究者檢測HPCAL1是否與鐵死亡相關蛋白結合。通過HPCAL1的CO-IP MS實驗，共發現在RSL3處理和未處理的HT-1080和Calu-1細胞中，與HPCAL1結合的蛋白有600多個。GO功能富集分析顯示粘著斑和細胞-底物接合是最顯著富集的條目。
研究者關注其中一個在RSL3處理后與HPCAL1結合變化倍數最大的蛋白CDH2。隨后，研究者分別用RSL3（鐵死亡激活劑）和STS（細胞凋亡誘導劑）處理細胞，并進行CDH2的CO-IP。結果表明，在鐵死亡狀態下而非細胞凋亡狀態下，CDH2與HPCAL1的結合加強。該結果顯示了HPACAL1-CDH2復合體在鐵死亡中的特殊作用。
接下來的研究顯示，當CDH2被敲低后，能恢復HPCAL1敲低細胞對RSL3或erastin的敏感性，而這種作用可以被鐵死亡抑制劑DFO而非細胞凋亡抑制劑Z-VAD-FMK逆轉。而在HPCAL1過表達的細胞中繼續過表達CDH2則會限制RSL3或erastin的細胞殺傷活性。綜合以上結果表明，HPCAL1通過劫持抗鐵死亡CDH2蛋白來促進鐵死亡。
?3.?HPCAL1介導CDH2降解
緊接著研究者探究HPCAL1-CDH2復合體的形成是如何抑制CDH2的抗鐵死亡作用。首先發現，在RSL3或erastin處理后，細胞中的CDH2蛋白表達顯著下調，而細胞凋亡誘導劑STS則不影響CDH2的表達。研究者隨后明確，CDH2的降解是鐵死亡過程中的自噬介導的，在鐵死亡過程中自噬流增強。
自噬受體一般會將吞噬泡和自噬小體上的MAP1LC3B-II和要降解的目標分子進行連接，因此研究者檢測了HPCAL1和MAP1LC3B-II的膜脂質定位。WB顯示在RSL3誘導的鐵死亡條件下，細胞膜組分中的HPCAL1和MAP1LC3B-II表達量均上升。HPCAL1可以與磷脂酰肌醇結合，這與此前報道的磷脂酰肌醇是自噬小體形成和成熟中關鍵的協調分子相一致。此外，CO-IP實驗也證實，在RSL3誘導的鐵死亡條件下，膜組分存在HPCAL1、CDH2和MAP1LC3B-II的結合。
下一步，研究者的實驗表明：（1）在鐵死亡中HPCAL1選擇性地介導CDH2蛋白的自噬降解。（2）HPCAL1上預測到的兩個LIR（LC3互作區）motif ：DEFFKKI (aa 46-51) 和AIYKMV (aa 127-132)。HPCAL1突變實驗表明， Δ127-132缺失不影響HPCAL1與LC3的結合，而Δ46-51缺失則影響HPCAL1與LC3的結合。此外，Δ46-51缺失抑制RSL3或erastin誘導的CDH2降解。
?4.?PRKCQ介導的HPCAL1磷酸化促進CDH2的降解
研究者繼續探索了HPCAL1磷酸化是否以及如何調控鐵死亡中的CDH2降解。研究者通過實驗初步確認PRKC（蛋白激酶C）的底物選擇性參與鐵死亡相關的自噬。隨后，研究者明確HPCAL1是PRKC的潛在底物。生信預測顯示，PRKC可能磷酸化HPCAL1 149位蘇氨酸（Thr）的磷酸化。功能實驗表明，過表達野生型HPCAL1（Thr149）增強CDH2降解，而過表達磷酸化突變（T149A，149位蘇氨酸突變為丙氨酸）則較少CDH2的降解。兩個PRKC抑制劑則抑制RSL3或erastin誘導的鐵死亡。以上結果表明，PRKC依賴的HPCAL1磷酸化介導了鐵死亡中CDH2的降解。此外，研究者的實驗表明，是PRKC家族中的PRKCQ Thr538的磷酸化使的PRKCQ激活，參與了鐵死亡。
接下來，研究者檢測了PRKCQ在鐵死亡中的作用。結果表明，鐵死亡激活劑RSL3而非凋亡誘導劑STS能增強PRKCQ和HPCAL1的結合。PRKCQ敲低限制了RSL3或erastin誘導的癌細胞生長抑制。PRKCQ敲低保護細胞免受細胞死亡、脂質過氧化和CDH2的自噬降解。此外，在細胞缺失HPCAL1和CDH2的情況下，敲低PRKCQ不影響細胞對鐵死亡敏感性。這表明，PRKCQ是鐵死亡的上游信號。
?5.?鑒定HPCAL1抑制劑（iHPCAL1）可作為鐵死亡的抑制劑
研究者從4208個無明確靶點的小分子中篩選新的HPCAL1抑制劑。實驗發現，有157個化合物能抑制RSL3誘導的細胞死亡。接下來，研究者檢測這157個化合物中哪些可以降低HPCAL1的蛋白表達水平。結果發現，#5和#155號化合物可以顯著抑制HPCAL1蛋白表達。隨后，研究者關注既不是抗氧化劑也無鐵螯合劑活性的#5號化合物，并將之命名為iHPCAL1。分子對接實驗（molecular docking assay）顯示iHPCAL1可以與HPCAL1結合。
細胞熱遷移分析（cellular thermal shift assay）證實iHPCAL1延緩熱誘導的HPCAL1蛋白降解，表明iHPCAL1直接與HPCAL1相互作用。功能分析表明iHPCAL1不能影響PRKCQ的磷酸化，但可以抑制HPCAL1的磷酸化以及RSL3或erastin誘導的CDH2的自噬降解。這些結果表明，iHPCAL1誘導的HPCAL1磷酸化和功能的抑制發生在PRKCQ 磷酸化的下游。隨后的研究表明硼替佐米（泛素-蛋白酶體抑制劑），而不是氯喹（自噬抑制劑），可以阻止iHPCAL1誘導的HPCAL1蛋白降解。這些結果表明iHPCAL1通過蛋白酶體途徑刺激HPCAL1的降解，從而限制了鐵死亡。
?6.?體內實驗檢測HPCAL1介導的鐵死亡響應
Imidazole ketone erastin (IKE)是一種具有更好效力和代謝穩定性的erastin類似物，適用于在動物研究評估鐵死亡對腫瘤抑制的影響。研究者構建了HPCAL1敲低的HT-1080癌細胞異種移植瘤裸鼠模型，并發現敲低HPCAL1限制了IKE的腫瘤抑制作用。HPCAL1敲低組與對照組相比，CDH2蛋白水平升高，而MAP1LC3B-II降低。鐵死亡生物標志物的定量結果以及血清中HMGB1的濃度進一步支持HPCAL1促進了IKE誘導的體內鐵死亡的假設。同樣地，iHPCAL1在異種移植瘤模型中抑制IKE的抗癌活性，而對IKE誘導的GPX4降解無顯著影響。這些動物體內研究與體外研究一致，表明HPCAL1是鐵死亡的正調節因子。
隨后，研究者利用蛙皮素（cerulein）誘導胰腺條件性敲除GPX4的小鼠發生急性胰腺炎，并檢測iHPCAL1是否有保護作用。結果顯示，iHPCAL1能很好地改善急性胰腺炎中的各項生化指標，具有顯著的保護作用。與預期一致，在使用iHPCAL1后，HPCAL1蛋白水平下調。綜合以上結果表明，HPCAL1參與了鐵死亡誘導的急性胰腺炎。
研究總結
研究者利用定量蛋白質組學篩選到了一個參與鐵死亡的膜蛋白HPCAL1。HPCAL1作為一種特異性自噬受體，在鐵死亡過程中選擇性降解CDH2(鈣粘蛋白2)。CDH2耗竭又進一步通過降低膜張力和促進脂質過氧化而增加鐵死亡的易感性。深入的機制研究發現，CDH2的自噬降解需要PRKCQ(蛋白激酶C theta)介導的HPCAL1在Thr149上的磷酸化，以及位于46-51位氨基酸之間的非經典LC3互作區域motif。最后，研究者從4208個小分子化合物的藥物篩選中確定了一種抑制HPCAL1表達的鐵死亡抑制劑。在小鼠模型中，HPCAL1的抑制阻止了鐵死亡誘導的腫瘤抑制和胰腺炎。研究者的發現為自噬依賴細胞死亡的機制提供了見解，并為靶向HPCAL1以預防致病性鐵死亡提供了可能性。
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