骨骼系統作為人體八大系統之一，在人體中發揮著重要的作用。但是因為一些客觀的因素比如交通的進步、生活方式以及居住環境的改變，導致和骨骼系統相關性的疾病的發生率也越來越高。所以說現在關于骨骼細胞的研究也越來越深入。骨骼的成分之一是礦物質化的骨骼組織，其內部是堅硬的蜂巢狀立體結構；其他組織還包括了骨髓、骨膜、神經、血管和軟骨。

同時關于基因治療的研究也如火如荼，在基因治療方面AAV就是最常用的基因遞送的載體。對于做基礎研究的老師們或者是臨床做科研的老師們而言，如何用AAV靶向骨骼系統實現目的細胞的調控，是老師們最關心的點。針對骨骼系統的AAV靶向策略會分成上下兩期進行講解。本期主要介紹針對骨骼細胞AAV的血清型以及注射方式。

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血清型

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骨骼系統里骨組織包含的細胞主要有四種：骨祖細胞、成骨細胞、骨細胞以及破骨細胞。在Bone-targeting AAV-mediated silencing of Schnurri-3 prevents bone loss in osteoporosis這篇文獻^[1]中，作者在體外檢測了不同血清型AAV對成骨細胞（COB），骨髓間充質來源的成骨前體細胞（BM-OCP）和軟骨前體細胞系（ATDC5）的感染效率，結果表明Raav1，4，5，6，7，9，rh10和rh39等八種血清型的AAV在體外成功感染成骨細胞。在體內作者利用關節腔注射的方式檢測上述血清型對于體內的感染效率。結果表明只有rAAV9可以成功感染松質骨和皮質骨處的骨骼細胞，包括骨細胞、成骨細胞和破骨細胞等。

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注射方式

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對于骨骼系統的AAV靶向策略來說，骨骼系統的結構分為三種注射方式。一種是針對骨骼系統特異性的注射方式：骨關節腔注射，另一種是常規的靜脈注射還有一種是針對骨髓的骨內注射。

骨關節腔內注射：

上述的文獻中，作者采用了膝關節注射AAV到兩個月大的小鼠的膝關節內。注射的劑量都是1E11gc，滴度是在1-6E12gc/ml的范圍內。

除此之外，Runx1 protects against the pathological progression of osteoarthritis這篇文獻^[2]是使用了吉凱產品的客戶文獻，作者在這里采用的也是采用的關節腔內注射的方式，滴度是1E11vg/ml，每個關節5μl的注射量，感染8周齡的小鼠，在感染之后的12和24周收集膝關節組織。在ACLT手術24周之后，作者通過HE、Masson檢測Runx1對于骨關節晚期生長板的影響。結果表明，Runx1過表達會保留生長軟板的厚度。

骨內注射：

在Adeno associated viral-mediated intraosseous labeling of bone marrow derived cells for CNS tracking這篇文獻^[3]中，作者采用了骨內注射的方式，滴度為4.5E13vg/ml，注射體積為5μl，感染四個月的小鼠。對于骨內注射的具體的操作步驟如下：

1. 用異氟烷對小鼠進行麻醉，雙膝屈曲，膝后各有一個支撐物。剃除關節周圍的毛發，用 70% 的酒精和碘酒清潔關節區域。

2. 用1毫升注射器，將25號針頭插入股骨內間隙，在脛骨和股骨關節之間的股骨頂部髁之間輕輕扭轉并施壓，將25號的針頭和針帽留在原處，輕輕取出 1 毫升注射器。

3. 將帶有32G針頭的漢密爾頓注射器插入塑料蓋開口。32G骨髓針在距針尖3.5厘米處做標記，以指示穿刺長度。

4. 將病毒緩慢注入股骨柄。然后慢慢取出以限制回流。輕輕拔出針頭，觀察小鼠讓其恢復。

靜脈注射：

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在Bone-targeting AAV-mediated silencing of Schnurri-3 prevents bone loss in osteoporosis這篇文獻^[1]中，作者除了采用關節腔注射之外，還采用了靜脈注射的方式。如上圖所示，作者為了測試AAV9在體內系統遞送時靶向骨組織的能力，將rAAV9-EGFP注射到2個月大的小鼠體內，并通過EGFP的表達評估 rAAV9 在組織中的分布。在這里作者采用的就是靜脈注射的方式，劑量是4E11gc，注射兩周之后評估綠色熒光的分布能力。結果表明，EGFP主要在骨皮質和骨小梁中的骨內膜成骨細胞和骨細胞中表達，而在韌帶、關節軟骨和骨韌帶中則沒有表達。這些結果表明，系統遞送的 rAAV9 向量靶向骨內的成骨細胞。

綜上，建議各位老師針對體內的骨骼系統的AAV感染策略上采用AAV9+骨關節腔注射的方式搭配。針對骨骼系統里面不同的細胞具體采用的特異性啟動子的類型我們將在下期進行詳細的介紹，有相關需要的老師請持續關注我們。

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參考文獻…

1. Yang, Y.-S., et al., Bone-targeting AAV-mediated silencing of Schnurri-3 prevents bone loss in osteoporosis.?Nature Communications, 2019. 10(1).

2. Zhou, C., et al., Runx1 protects against the pathological progression of osteoarthritis.?Bone Research, 2021. 9(1).

3. Selenica, M.-L.B., et al., Adeno associated viral-mediated intraosseous labeling of bone marrow derived cells for CNS tracking.?Journal of Immunological Methods, 2016. 432: p. 51-56.