中國醫科大學附屬盛京醫院劉揚和孫思予教授研究團隊通過研究表明脂滴形成在肝細胞癌（HCC）細胞對索拉非尼（sorafenib）的適應性中至關重要，并利用基于質譜的脂質組和蛋白質組揭示了其中重要的調控基因和作用機制。研究成果以“AKR1C3-dependent lipid droplet formation confers hepatocellular carcinoma cell adaptability to targeted therapy”為題，發表在Theranostics（IF：11.600）上。
研究結果
1.索拉非尼抗性的肝癌細胞中存在著脂肪酸氧化（FAO）向糖酵解轉變導致的脂滴積累
研究者首先構建了兩株索拉非尼抗性的肝細胞癌（HCC）細胞系，分別為HepG2R 和HuH7R。隨后，檢測了索拉非尼抗性癌細胞的耗氧率（OCR）和細胞外酸化率（ECAR）。結果顯示，抗性癌細胞的OCR下降，ECAR上升，ECAR/OCR的比率也顯著上升。糖酵解代謝流檢測發現，糖酵解增強。此外，研究還發現，抗性癌細胞完全廢棄了脂肪酸氧化（FAO）。研究者進一步檢測了細胞內無法被線粒體正常代謝的脂肪酸是否儲存在脂滴中。結果顯示，在索拉非尼和瑞戈非尼（Regorafenib）存在時，HepG2R 和HuH7R細胞里均檢測到了清晰的脂滴。索拉非尼處理能增加原始癌細胞中線粒體活性氧（ROS）的產生，而在抗性癌細胞中僅有少量ROS的產生。此外，在抗性癌細胞的線粒體周圍檢測到了明顯的脂滴積累，這表明脂肪酸（FA）轉化為了甘油三酯（TAG）進行存儲。為了確定脂滴形成是否對索拉非尼抗性有關鍵作用，研究者這使用Triacsin C對酰基輔酶A合成酶進行抑制進而阻止脂滴形成，結果抑制了索拉非尼抗性癌細胞的生長。
2. 脂質組學和蛋白質組學聯合分析發現AKR1C3是TAG聚集的調控因子
接下來，研究者對抗性癌細胞和原始癌細胞進行了脂質組學檢測，結果顯示TAG（甘油三酯）是在抗性癌細胞中上調最顯著的代謝物，此外，前列腺素（PG）在抗性癌細胞中也普遍上調。為了找到調控TAG聚集的關鍵蛋白質，研究者對抗性癌細胞和原始癌細胞分別進行了蛋白質組學檢測，有5個蛋白，包括HSD17B5 （AKR1C3）、TYB10、MGST1、 FSCN1和ANXA2在抗性癌細胞中上調。已有報道表明，AKR1C3與多囊卵巢綜合征（PCOS）脂肪細胞中的脂質代謝和脂質形成相關，因此，研究者決定探究AKR1C3在肝細胞癌脂質代謝中的作用。
WB證實了AKR1C3在抗性癌細胞中的高表達。在抗性癌細胞中還檢測到了脂肪酸合成酶（FASN）表達和乙酰輔酶A羧化酶（ACC）活性的上升。研究者構建了AKR1C3過表達的原始癌細胞HepG2-AKR1C3，并進行了脂質組學檢測，結果顯示HepG2-AKR1C3的脂質組學特征與抗性癌細胞的脂質組學特性相似，都有上升的甘油三酯（TAG）和前列腺素（PG）。此外，AKR1C3過表達通過下調p-ACC-s79和上調FASN的表達促進了脂質生成和脂滴產生，這與抗性癌細胞HepG2R中觀察到的現象一致。綜合以上結果表明，AKR1C3對脂滴形成有關鍵作用。
3. AKR1C3的缺失廢除TAG（甘油三酯）的積累并刺激FAO（脂肪酸氧化）
為了確定AKR1C3缺失是否影響肝細胞癌的脂質積累，研究者利用CRISPR/Cas9系統敲除了抗性癌細胞HepG2R中的AKR1C3并進行脂質組學檢測。結果表明，最明顯改變的代謝物富集在甘油磷脂代謝、甘油脂代謝和糖基磷脂酰肌醇（GPI）-錨定蛋白生物合成途徑。此外，AKR1C3的缺失明顯導致甘油三酯（TAG）的耗竭，以及二酰基甘油（DAG）、甘油磷脂（PC、LPC、PI、PS）和鞘磷脂（Cer、SM）種類的上調。此外，與對照組相比，AKR1C3-/-HepG2R細胞中的線粒體β-氧化增強。在AKR1C3-/-細胞中也明顯觀察到線粒體膜電位和活性氧（ROS）生成的增加?？傊?，這些結果證明，AKR1C3的缺失抑制了細胞內甘油三酯（TAG）的積累，促進了脂肪酸運輸到線粒體進行β-氧化。
4. AKR1C3依賴的脂滴形成阻止線粒體功能障礙和脂肪毒性
研究者假設AKR1C3通過抑制脂滴分解促進脂滴形成。因為在AKR1C3-/-細胞中存在脂滴積累，于是研究者使用兩種AKR1C3的抑制劑，檢測當AKR1C3活性被抑制后，是否會引起脂滴分解。研究者對AKR1C3抑制劑FLU（氟芬那酸）或5-βCA（5β-膽烷酸）處理后的抗性癌細胞HepG2R分別進行脂質組學檢測。結果與AKR1C3-/-細胞相一致，在索拉非尼存在的條件下，抑制AKR1C3顯著降低細胞甘油三酯（TAG）和脂滴的含量，而磷脂和鞘脂類脂質包括PE、PG、PI、PS和SM的含量則上升。同時還檢測到抑制AKR1C3能顯著降低甘油三酯（TAG）的減少以及細胞內游離脂肪酸（FFA）的增加，提示線粒體中β-氧化作用的減弱。研究者對線粒體功能的檢測也發現抑制AKR1C3造成線粒體功能障礙。
5. AKR1C3抑制脂質自噬以支持脂滴形成
接下來研究者探究AKR1C3是如何調控脂質積累的。鑒于AKR1C3的基本功能是調控PG（前列腺素）合成，研究者首先檢測了PG代謝是如何促進脂質積累的。結果表明AKR1C3介導的索拉非尼抗性和脂滴積累是PG非依賴性的。
已有研究表明，抑制AKR1C3能增強胃腸癌細胞系中阿霉素誘導的細胞自噬，因此研究者假設AKR1C3可能通過自噬介導的脂滴分解（脂質自噬）調控脂滴穩態。通過mCherry-GFP-LC3 融合蛋白實驗表明，抑制AKR1C3能增強細胞自噬。加強細胞自噬能在AKR1C3抑制的條件下誘導更顯著的脂滴清除，而這種清除作用會被自噬抑制劑減弱。進一步研究發現，在AKR1C3抑制劑和索拉非尼聯合處理條件下，自噬/脂質自噬的抑制或者敲低ATG5都能顯著增強細胞生存，減少凋亡細胞數量，細胞顯示出減少的細胞色素C釋放和活性氧（ROS）生成，并有脂滴的增加，且線粒體膜電位能恢復到正常區間。綜合以上結果表明，AKR1C3通過脂質自噬調控脂滴穩態。
6. AKR1C3促進代謝從氧化磷酸化轉向糖酵解
為了檢測AKR1C3是否會影響能量代謝，研究者對原始癌細胞中過表達AKR1C3或在抗性癌細胞中敲低AKR1C3。過表達AKR1C3后，原始癌細胞的耗氧率（OCR）下降，細胞外酸化率（ECAR）上升，ECAR/OCR比值上調3.7倍。在抗性癌細胞中敲低AKR1C3后，耗氧率（OCR）上升，細胞外酸化率（ECAR）下降，，ECAR/OCR比值下降2倍。此外，過表達AKR1C3降低了AMPK-T172磷酸化、PPARα和CPT1A的水平，但增加了HK2的蛋白水平。而AKR1C3的抑制恢復了索拉非尼處理的癌細胞中上述蛋白的水平。此外，與對照細胞相比，高表達AKR1C3的HepG2細胞對葡萄糖表現出更大的生長依賴性。相反，與對照組相比，AKR1C3-/- HepG2R細胞對葡萄糖的敏感性較低。最后，在索拉非尼處理條件下，AKR1C3過表達明顯提高了HepG2細胞的存活率，而敲除AKR1C3使HepG2R細胞對索拉非尼敏感。這些結果表明，AKR1C3使代謝從脂肪酸氧化轉向糖酵解，以促進HCC細胞對索拉非尼的抗性。
7. AKR1C3維持索拉非尼處理條件下肝細胞癌細胞的生長
接下來，研究者探究了索拉非尼和FLU （氟芬那酸，AKR1C3抑制劑）聯合治療對肝細胞癌細胞的影響。結果表明，聯合治療強烈地抑制了抗性癌細胞HepG2R和HuH7R異種移植瘤的生長。免疫組化顯示CPT1A和PPARα的表達明顯升高，提示細胞存在脂滴分解。油紅染色實驗證明，聯合治療降低了肝細胞癌細胞異種移植腫瘤中的脂滴積累。進一步，研究者觀察了AKR1C3-/-HepG2R移植瘤小鼠的腫瘤生長情況。結果表明，AKR1C3缺失與索拉非尼協同作用，通過誘導脂肪吞噬來抑制腫瘤生長。以上基于肝細胞癌細胞異種移植瘤模型的研究表明，抑制AKR1C3會誘導脂滴分解和線粒體脂質毒性，從而使耐藥的肝細胞癌細胞對索拉非尼敏感。
研究總結
本研究發現，長期的索拉非尼治療會損害脂肪酸氧化（FAO），導致肝細胞癌（HCC）細胞中脂滴（LD）的積累。對索拉非尼抗性和原始癌細胞的脂質組學和蛋白質組學聯合分析發現，醛酮還原酶AKR1C3是肝細胞癌中脂滴積累的重要調控基因。AKR1C3缺失完全消除脂滴含量，使游離脂肪酸流向磷脂、鞘脂和線粒體。此外，研究者發現AKR1C3依賴的脂滴積累是緩解索拉非尼誘導的線粒體脂肪毒性和功能障礙的必要條件。藥物抑制AKR1C3的活性會立即誘導自噬依賴的脂滴分解，導致線粒體裂變和索拉非尼抗性肝細胞癌細胞凋亡。改變AKR1C3的表達足以驅動脂肪酸氧化和糖酵解之間的代謝轉換。AKR1C3可作為肝細胞癌治療的一個潛在靶標。
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