基因功能缺失是研究基因功能的常用方法之一，當前主要通過RNAi或者Crispr/cas9兩種途徑實現。這兩大技術已經發展完善，應用極其廣闊，但即便針對人區區兩萬個基因，也沒有一家公司能夠提供100%有效的商業化靶點，換言之，基因的knockdown或者knockout不是那么簡單的。為何呢？
當前靶點敲低的現狀
首先，我們梳理下兩大技術的商業化產品類型，先說國外的，RNAi以sigma為例，其官網針對每個基因提供六個靶點的產品，同樣，張鋒的cas9文庫同樣針對每個基因設計六個靶點；國內的絕大多數提供該產品的公司，都是設計3~5個靶點，才承諾一個靶點在RNA水平有敲低效果。
說到底，無論哪種下調技術，都無法保證設計的靶點一定是有效的，所以才需要同時設計多個，通過驗證，找出有效的那個?？吹竭@，你或許有疑問：明明靶點就是針對基因設計的，為何還無效呢？因為靶點的有效性受限于眾多因素，以RNAi為例，影響靶點的因素包括：
（1）基因的表達水平：表達越低，敲減越難；
（2）RNA的二級結構：RNA本身是單鏈的，其序列某些區域可能互補，靶點就無法結合；
（3）載體結構：不同骨架的載體，表達shRNA的水平是有差異的；
（4）細胞系差異：同一個靶點，在不同細胞的敲減效率是有差異的；
當然，影響靶點有效性的因素不單單包含上面的4點，我們常常碰到，同一個靶點感染同一種類型的細胞，效率都有差異，這就很魔幻了，無法解釋啊。所以，生物類的實驗重復率低嘛，當你興沖沖查到一個高分文獻的有效靶點，并定制，最后驗證無效，不要懷疑，不是別人造假，這也是正?，F象。而cas9受限于基因組上SNP等因素的影響，即便驗證出有效靶點，換個細胞，也可能因為靶點剛好在SNP上而無效。
說了這么多，小編不是在販賣焦慮，而是說明了做基因功能缺失的難處，當然，是本著支招的目的去的，有沒有可嘗試的手段呢？那就是今天要分享的文獻，多靶點串聯用于基因下調。前面我們講了，設計一個靶點可能是無效的，那就設計多個靶點，同時驗證，等于做多個備胎，但如果將多個靶點構建在一起呢，不就省略了驗證多個的情況嗎，效果會好嗎？
新思路-多靶點串聯驗證
Weng1等人針對紅色熒光設計了三個靶點，分別構建進入U6啟動子的載體，同時構建了一個三個靶點串聯在一起的載體，并轉入帶有紅色熒光的細胞：
隨后，作者從熒光強度、RNA水平表達活性、WB水平表達程度三個維度分析，發現三個靶點串聯的DsRed-3shRNA下調基因的水平都優于三個單獨的shRNA，證實了，多靶點串聯的優越性：
dsRed是外源轉入細胞并敲低的，那針對內源性基因，敲低效果如何呢？作者選擇卵巢癌細胞高表達的Akt2 作為靶標，設計單個靶點、雙靶點串聯、三靶點串聯的三種病毒組合，分別感染細胞，結果如下：
若要在同一個細胞中同時下調多個基因，若采取單靶點構建形式，勢必要轉入多個載體，這無疑會加大實驗操作難度，因為不同的載體都需要篩選，費時費力。Fink2等人采取多靶點串聯構建策略，針對不同基因設計靶點串聯構建，與單靶點構建做對比，同樣證實前者的有效性：
上述針對不同基因設計靶點串聯構建的形式，在動物水平應用更加廣泛。因為單只動物，其某一部位，注射的病毒量、體積都是受限的，若要同時操作多個基因，難度更大，而多靶點串聯對于基因下調則是優選，Platt3等人使用單個aav病毒，運用cas9的方式敲除肺腺癌中前三個顯著突變的基因KRAS、p53和LKB1，從而建立了疾病模型：
你看，同時敲三個基因，只需要一個病毒即可，是不是很省錢，很有效呢？
總 結
串聯構建法對于基因的下調是很有利的，那為啥不如單個靶點使用廣泛呢？構建單靶點，成本低、構建快；但是多靶點串聯，其成本很高，周期也較長，也不能100%保證有效，所以限制了其發展。但對于動物實驗者，若沒有有效靶點，又沒條件篩選的話，串聯不失為最佳的選擇，總比隨意設計一條碰運氣要強很多。
吉凱基因有豐富的靶點設計經驗，及提供眾多形式的篩靶服務，當然，也提供靶點串聯方案的設計，想嘗試的，受困于無有效靶點的你，還在等什么，趕緊來嘗試吧?。?！
【參考文獻】
1.A multi-shRNA vector enhances the silencing efficiency of exogenous and endogenous genes in human cells
2.A simple approach for multi-targeted shRNA-mediated inducible knockdowns using Sleeping Beauty vectors
3.CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling