小鼠腫瘤模型的建立為腫瘤的生物學研究以及藥物的開發提供了重要的實驗平臺。當前腫瘤模型多集中于裸鼠成瘤，即基于先天性胸腺缺陷的突變小鼠注射外源腫瘤細胞建立模型，而基于小鼠自身衍生的原位瘤模型較少。小編從CELL找了一篇集成AAV及Cas9技術建立的小鼠原位肺腺癌模型，有望推動更多原位瘤的建立，看看大牛是怎么做的吧！??！
Cas9模型鼠建立
作者將 Cas9 轉基因表達盒插入 Rosa26 基因座來生成依賴于 Cre 的 Cas9 小鼠。轉基因由 3× FLAG 標記的化膿性鏈球菌Cas9 組成，該 Cas9 通過自切割 P2A 肽與增強型綠色熒光蛋白 (EGFP) 連接，以促進表達 Cas9 的細胞的可視化。轉基因由普遍存在的 CAG 啟動子驅動，并被 loxP-stop（3x polyA 信號）-loxP (LSL) 盒中斷，從而使 Cre 重組酶可誘導 Cas9 表達。
為了評估延長 Cas9 表達的影響，通過將 Cre 依賴性 Cas9 小鼠與 β-肌動蛋白 Cre 驅動器雜交來生成組成型 Cas9 表達小鼠系,在整個身體中觀察到 Cas9-P2A-EGFP 表達。組成型表達 Cas9 的小鼠可生育，產仔數正常，無形態異常，并且能夠繁殖至純合子。在細胞水平上，還沒有發現 DNA 損傷和凋亡標志物的形態異?；蛏险{，表明Cas9蛋白的表達不會引發細胞功能學的變化。
多基因癌癥突變的體內建模
Cas9 介導的基因組編輯的多重性使多基因疾病過程（例如腫瘤發生）的建模成為可能。癌細胞的基因組具有復雜的遺傳損傷組合，這通常包括原癌基因的功能獲得性突變以及抑癌基因的功能喪失性突變。作者選擇對涉及癌基因Kras和抑癌基因p53和Lkb1的肺腺癌突變進行建模，它們是人類肺腺癌中最常見的三個突變基因（p53為 46%，KRAS 為33%，LKB1為17% )，患者腫瘤中的p53和LKB1突變在本質上通常是功能喪失，因此直接設計單靶點將其敲除；但KRAS中的突變通常是導致功能獲得的錯義突變，為了模擬錯義功能獲得Kras突變，作者設計了一個 HDR 供體模板，將第 12 個氨基酸位置的甘氨酸 (G) 到天冬氨酸 (D) 突變，導致致癌KrasG12D突變。上述元件與包含 Cre 重組酶和海腎熒光素酶的表達盒組成AAV-KPL，并以氣管內注射病毒的方式導入小鼠體內：
4 周后，從AAV9-KPL轉導的小鼠和AAV9-sgLacZ轉導的對照中收獲肺，并通過 Illumina 測序進行表征。在預測的切割位點發現了p53和Lkb1中的插入缺失，占 0.1%整個肺中的p53插入缺失和0.4% Lkb1插入缺失，0.1% KrasG12D HDR。
注射后兩個月，所有（5 個中的5個=100%）AAV9-KPL治療的動物在肺中出現結節，而對照沒有，兩個月的平均總腫瘤負荷為~33 mm3，接近肺總體積的10%。
轉導后 9 周注射 AAV9-KPL 或 AAV9-sgLacZ 的 Cre 依賴性 Cas9 小鼠的代表性立體顯微鏡肺圖像，顯示EGFP陽性腫瘤僅在注射 AAV9-KPL 的小鼠的肺內。解剖整個肺和單個腫瘤的Kras、p53和Lkb1突變分析，顯示p53和Lkb1突變在快速生長的腫瘤中占主導地位，KrasG12D突變頻率在整個組織中隨時間增加（全葉水平由0.5%增加至1.8%），但在大腫瘤中不富集。這些數據表明，最大和生長最快的解剖腫瘤不依賴致癌Kras的生長，要么是因為p53，Lkb1雙突變腫瘤在競爭中勝過含有KrasG12D的腫瘤，要么是因為在該模型中通過 HDR激活KrasG12D具有更長的潛伏期。
為了了解通過注射 AAV9-KPL 形成的腫瘤的病理學，作者進行了蘇木精和伊紅 (H&E) 染色和免疫組織化學 (IHC)。病理學顯示，在注射后 1 個月出現多個 I 級和 II 級支氣管肺泡腺瘤，在 2 個月內發展為 III 級肺腺癌，偶爾會發展為侵襲性 IV 級腺癌。大多數腫瘤 (178/182 = 95.7%) 前表面活性劑 C (pSPC) 染色陽性，pSPC 是 II 型肺細胞的標志物，暗示這些腫瘤中的多數起源于這種細胞類型。且Ki67(活躍的細胞周期蛋白)及CD31（血管內皮細胞標志物）染色陽性，表明腫瘤細胞增殖速度快且伴隨血管生成。
小編心得
本文提供了較優的利用病毒介導小鼠原位成瘤的方法，與傳統物理或者化學方法相比，病毒法操作簡單，無其他毒副作用。雖然本文介紹的是肺原位成瘤，但不同腫瘤的發生往往伴隨類似的基因突變，如抑制癌基因（P53,LKB1）的失活，按照本文的論述，最終推動腫瘤快速生長的依靠兩個基因失活就足夠了，當然，不同腫瘤可以考慮納入其他基因的修正或失活。雖然本文依靠建立內源性的Cas9鼠搭配單個AAV，考慮到很多老師無法快速獲得此種小鼠，可以考慮采取雙病毒，一種表達Cas9，一種表達sgRNA，達到修正基因的目的。吉凱基因提供廣泛的基因操作工具，滿足不同課題的設計需要，對AAV感興趣的老師，快來咨詢吧！！!
【參考文獻】
1.CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling